Abstract
El lente del ojo es un órgano transparente que refracta y enfoca la luz para formar una imagen nítida en la retina. En los seres humanos, los músculos ciliares contrato para deformar la lente, lo que lleva a un aumento de la potencia óptica de la lente para enfocar objetos cercanos, un proceso conocido como alojamiento. cambios relacionados con la edad en la rigidez de la lente se han vinculado a la presbicia, una reducción en la capacidad de la lente 'para acomodar, y, por extensión, la necesidad de gafas de lectura. A pesar de que las lentes de ratón no se acomodan o desarrollar la presbicia, modelos de ratón pueden proporcionar una herramienta invaluable para patologías genéticas de lentes de comprensión, y el envejecimiento acelerado observado en ratones permite el estudio de los cambios relacionados con la edad en la lente. Este protocolo se muestra un método simple, preciso y rentable para la determinación de la rigidez de la lente ratón, utilizando cubreobjetos de vidrio para aplicar secuencialmente creciente cargas de compresión sobre la lente. Representante de datos confirman que las lentes de ratón se vuelven más rígidos con la edad, comolentes humanos. Este método es altamente reproducible y potencialmente se puede escalar hasta mecánicamente lentes de ensayo de los animales más grandes.
Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por los Institutos Nacionales de Salud y en virtud de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Instituto de Investigación Scripps.
1. Lente Disección
- La eutanasia a los ratones de acuerdo a las recomendaciones de los Institutos Nacionales de la Salud "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" y protocolos para el uso de animales institución aprobados.
- Enucleación del ojo de los ratones utilizando pinzas curvas. Presione el tejido alrededor del ojo con las pinzas para llevar el ojo de la toma, y luego arrancar el ojo de la toma con las pinzas. Transferir a los ojos frescos de fosfato 1x (PBS) en el plato de la disección.
- Cortar el nervio óptico tan cerca del globo ocular como sea posible. Suavemente y con cuidado inserte pinzas rectas finas en el globo ocular a través del orificio RCEste el nervio óptico sale de la parte posterior.
- Con cuidado, hacer una incisión con tijeras en el globo ocular de la posterior hasta el borde de la córnea. lentes de roedores ocupan ~ 30% de los ojos. Hacer estas incisiones cuidadosamente, y no introduzca pinzas o tijeras demasiado profundo en el ojo para no dañar la pantalla.
- Corte a lo largo de la unión entre la córnea y la esclerótica al menos a mitad de camino alrededor del globo ocular.
- Empuje suavemente sobre la córnea para extraer el cristalino del ojo a través de la abertura que se hace en los pasos 1.4 y 1.5.
- Utilice pinzas finas punta recta para quitar cuidadosamente cualquier escombros grandes que todavía está unido a la lente. una inspección visual de la lente de los daños antes de proceder a las mediciones de rigidez.
2. Las mediciones de rigidez
- Se pesan por lo menos 10 cubreobjetos de la misma caja utilizando una balanza analítica. Encontrar el peso medio de los cubreobjetos. Por consistencia, utilizar la misma caja de cubreobjetos para todos los experimentos. Pre-húmedaLos cubreobjetos y en ángulo recto espejo en 1x PBS a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de comenzar los experimentos.
- Llenar la cámara de medición (véase la Figura 1) con 65 - 75 ml de 1x PBS. La cámara de medición fue hecha de plexiglás por un taller de maquinaria en la empresa, y las chuletas en la cámara fueron realizadas por un taladro de columna ajustado a la profundidad deseada con una broca apropiada. Objetivos, permanecen transparentes en 1X PBS a temperatura ambiente durante la duración de la prueba mecánica.
Figura 1:. Rigidez cámara de medición Una foto que muestra las dimensiones de la cámara de medición de la rigidez a la medida con una variedad de chuletas de diferentes profundidades y formas. Las chuletas redondas que son 200 micras o 300 micras (puntas de flecha de color amarillo) de profundidad se utilizan para las mediciones en las lentes de ratón. Divots son 2 mm de diámetro y 13 ~-. 14 mm del borde de la cámara Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Coloque espejo de ángulo recto en la cámara a una distancia constante de la chuleta que se utiliza para mantener la lente. Asegúrese de que el espejo no se mueve durante el experimento.
- Transferencia de lentes de diseccionados a la cámara de medición cuidadosamente con unas pinzas o fórceps curvos incautación.
- Tome una vista superior de imagen de la lente descargada directamente desde arriba. Tome fotos de lentes de ratón en un aumento de 30x con la iluminación del microscopio de disección (abajo) y una fuente de luz de fibra óptica en los lados izquierdo y derecho. Establecer la fuente de alimentación de fibra óptica a 80% de la intensidad máxima de la luz. Ajustar la salida de la fuente de alimentación basado en la iluminación ambiental, las preferencias del usuario y la calidad de la imagen según sea necesario.
- Tome una imagen de vista lateral de la lente sin carga, que puede ser visto a través de la riEspejo GHT-ángulo. Si la cámara no está calibrado, tomar una foto del borde del espejo en el enfoque. El borde del espejo es de 5 mm de largo, y esta medición más adelante se puede utilizar para determinar la píxeles / mm y servir como una barra de escala en las imágenes.
- Lugar objetivo en la chuleta, y confirme que la lente esté firmemente asentada y recta en la chuleta. Tome una fotografía de la lente antes de la carga. La lente debe estar descansando en la chuleta en su anterior o polo posterior.
- Coloca 1 cubreobjetos con cuidado sobre la lente. Espere 2 minutos para permitir la fluencia, y tomar otro lado-vista de los cuadros de la lente cargado.
- Continuar añadiendo cubreobjetos como en el paso 2.8 y teniendo lado a ver las imágenes después de la adición de cada cubreobjetos como en el paso 2.8 hasta que se haya aplicado un total de 10 cubreobjetos.
- Eliminar todos los cubreobjetos. Espere 2 minutos, y tomar una vista lateral de imagen de la lente (dentro y fuera de la chuleta) tras retirar todos los cubreobjetos.
Medición de la lente 3. Núcleo
- para determine el tamaño núcleo del cristalino, la lente para mover una placa de Petri limpia llena de PBS 1x.
- decapsulate suavemente la lente con unas pinzas finas rectas.
- Desprenderse de las células de las fibras corticales rodando la lente entre los dedos enguantados. El núcleo del cristalino restante se sentirá como un duro mármol. Use este procedimiento para aislar el núcleo de las lentes para adultos a partir de 1 mes de edad. Puesto que el núcleo aislado es un cuerpo rígido, más pruebas mecánica del núcleo de la lente no se puede realizar el uso de este método descrito.
- Enjuague suavemente el núcleo de la lente en 1x PBS en la placa de Petri.
- Coloque el núcleo de la lente de nuevo en la cámara de medición (no en la chuleta), y tomar una imagen del núcleo de la lente a través del espejo en ángulo recto.
Figura 2:. A Objetivos de ratón comprimido por cubreobjetos (A) Esquema y (B) Fotografía de la exconfiguración experimental que muestra una lente de 2 meses de edad de ratón en una chuleta 200-m de profundidad en la cámara de medición llena de 1x PBS. Un espejo de ángulo recto y una cámara digital montada en un microscopio de disección se utilizaron para recoger imágenes de la lente durante la compresión por cubreobjetos. (C) Fotos de puntos de vista sagital de una lente de tipo salvaje de 2 meses de edad, comprimido por el número de cubreobjetos sucesivamente crecientes proporcionó los datos en bruto para medir diámetros axiales y ecuatoriales y el cálculo de las deformaciones axiales y ecuatoriales durante las pruebas de compresión basada en cubreobjetos. Un reflejo de la lente a veces se puede ver en los cubreobjetos (más claramente visible la imagen de la 1 cubreobjetos in). Cuando se hacen mediciones, ignorar la reflexión y medir hasta el vértice de la lente. (D) Fotos de vistas sagitales de los 2 meses de edad, la lente de tipo salvaje después de la compresión y el núcleo del cristalino aislado. La lente posterior a la compresión y el núcleo aislado están sentados fuera de la chuleta. Las barras de escala, 1 mm. Esta cifra se modificó a partir de Gokhen, et al. PLoS ONE, 2012 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Análisis 4. Imagen
- Medir diámetros ecuatoriales y axiales de las lentes antes de la carga y después de cada etapa de carga usando ImageJ o software similar. Medir el diámetro de cada núcleo de la lente. El núcleo de la lente es casi esférica por lo que una medición en cualquier orientación será suficiente 19,21.
- Corregir la lente axial diámetros mediante la adición de la profundidad de la chuleta utilizado. En la cámara de medición, el divot oscurecida 200 micras (lentes 2 meses de edad de ratón) o 300 micras (lentes de ratón 4 meses de edad y 8 meses de edad) de el espesor axial de la lente.
- Calcular la axial y cepas ecuatoriales de las mediciones de diámetro de la lente usando la ecuación, ε = (d - d 0) / d 0, donde ε es la cepa, d es el axial o correoQuatorial diámetro a una carga dada, y d 0 es el diámetro axial o ecuatorial correspondiente a carga cero.
- Trazar la axiales y ecuatoriales cepas en función de la carga impuesta (en mg).
- Trazar la axial, ecuatorial y diámetros nucleares. Calcular y representar gráficamente la relación de aspecto de la lente dividiendo el diámetro axial por el diámetro ecuatorial.
- Calcular y representar gráficamente el volumen de la lente usando la ecuación, volumen = 4/3 π × × r E 2 × r A, donde r es el radio E y r ecuatorial A es el radio axial medida a partir de la imagen tomada en el paso 2.6. Esta ecuación asume que el objetivo es un esferoide achatado (elipsoide) 1,22.
- Calcular y representar gráficamente el volumen nuclear usando la ecuación, volumen = 4/3 π × × r N 3, donde r N es el radio del núcleo de la lente como se mide desde la foto tomada en el paso 3.5. Esta ecuación supone que el i núcleo de la lentesa esfera 19,21.
- Calcular y trazar la fracción nuclear como la relación del volumen nuclear con el volumen de la lente.
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Representative Results
La rigidez y dimensiones de 2, 4 y 8 meses de edad lentes de ratón se midieron. Los ratones fueron todos los animales de tipo silvestre en un fondo de pura cepa C57BL6 obtenido a partir de la instalación de cría de animales TSRI y cada lente se cargó con 1 a 10 cubreobjetos. Las cepas axiales y ecuatoriales se calcularon como una función de la carga aplicada por la medición de la axial y diámetros ecuatorial de la lente después de la adición de cada cubreobjetos, y luego la normalización de cada cambio en el diámetro al diámetro sin carga correspondiente. Ocho lentes de cada edad se ensayaron, y los resultados se expresan como la media ± error estándar. Como se indica anteriormente 19, la deformación axial es una función logarítmica de la carga aplicada (Figura 3A). Hubo una disminución estadísticamente significativa dependiente de la edad en las cepas axiales y ecuatoriales bajo la carga máxima aplicada (Figura 3), indicando que la lente de ratón se endurece con la edad. Stmediciones de lluvia fueron altamente reproducible a través de las lentes de la misma edad, como se ha demostrado por los pequeños errores estándar.
También se utilizaron los datos de imagen recogidos durante este experimento para determinar varias características morfológicas otra lente (Figura 4). Como era de esperar, el volumen de la lente diámetros axiales y ecuatoriales y aumentó con la edad (Figura 4A, 4B y 4D). La relación de aspecto indica que la lente tiene un diámetro ecuatorial poco más grande que el diámetro axial, y este parámetro no cambia con la edad (Figura 4C). El diámetro, el volumen y la fracción del núcleo de la lente aumentaron con la edad (Figura 4E, 4F y 4G). Estos resultados sugieren que el núcleo de la lente remodela a aumentar de tamaño en relación con el envejecimiento de la lente.
Estos datos muestran que las lentes de ratón aumento de la rigidez con la edad, de forma similar a los cambios en unabio de lentes humanos 9,15. Estos datos también están de acuerdo con observaciones anteriores hechas usando un método similar 18 y por Brillouin microscopía óptica 23 que las lentes de ratón aumento de la rigidez con la edad. Otros dos estudios han utilizado el método descrito para demostrar que tropomodulina-1, un actina señaló de fin de limitación de proteínas, CP49, una proteína de filamentos intermedios con cuentas, y acuaporina 0 son necesarios para mantener la lente Rigidez 19,20. Con este método, la gran cantidad de modelos de ratón para las patologías de la lente y el envejecimiento acelerado de los ratones se puede utilizar para entender los cambios de rigidez de la lente debido a la variación genética y / o envejecimiento. Este método también puede ser adaptado para lentes de otras especies. Las dimensiones de la cámara utilizada para estos experimentos se han optimizado para lentes de ratón, pero se puede escalar fácilmente para lentes de las especies más grandes. En el futuro, sería interesante determinar si el tamaño de la lente se escala con la rigidez de la lente a través de especies.
Figura 3:. Axiales y ecuatoriales Curvas de tensión de carga para 2, 4 y 8 meses de edad (2 M, 4 M y 8 M) de tipo salvaje lentes de ratón (A) axial tensión de compresión representa como una función de la carga aplicada ( mg). los (B) Ecuatorialcepa ressive representa como una función de la carga aplicada (mg). Cuatro y lentes de 8 meses de edad mostraron menos tensión que las lentes de 2 meses de edad con cargas máximas equivalentes, lo que indica un aumento en la rigidez de la lente con la edad. **, P <0,01. Tenga en cuenta que el eje Y es diferente entre (A) y (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Características morfológicas de 2, 4 y 8 meses de edad (2M, 4M y 8M) de tipo salvaje Objetivos del ratón (A) de diámetro axial y (B) diámetro ecuatorial aumenta progresivamente con la edad. La relación de aspecto de la lente (C) muestra que las lentes de ratón son un poco más ancha en el ecuador de la lente. volumen de la lente (D), el diámetro nuclear (E), el volumen nuclear (F) y la fracción nuclear (G) aumentar progresivamente con la edad. **, P <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varias consideraciones clave al utilizar este método para medir la rigidez de la lente. En primer lugar, los cubreobjetos se aplican a la lente en un ángulo ligeramente oblicuo (8-8,5 °) con respecto a la parte inferior de la cámara (θ). Esto se aplicará un componente muy pequeño de la carga ecuatorial en lugar de axialmente. Sin embargo, esta carga ecuatorial se considera insignificante porque el pecado θ ≈ 0,1 19. Si este método se adapta para lentes más grandes, tendría que ser medida para determinar si la carga ecuatorial debe tenerse en cuenta en los cálculos de deformación del ángulo de los cubreobjetos a la parte inferior de la cámara. En segundo lugar, es crucial para permitir que la lente se equilibre después de la adición de cada cubreobjetos. El período de espera de 2 minutos permite la deformación dependiente del tiempo (es decir., La fluencia) que se produzca, de manera que sólo las imágenes se toman cuando el objetivo se encuentre en una forma de equilibrio 19. En tercer lugar, este protocolo está optimizado para medir la tensión de compresión en mOuse lentes a través de un amplio rango dinámico de cargas. En estudios piloto, una carga aplicada de 1293 mg (es decir, diez 18 x 18 mm cubreobjetos) comprime la lente ratón a una deformación máxima, más allá del cual se incrementaron las cargas no causan deformación adicional apreciable. Esto es debido a la presencia del núcleo de la lente rígida que no se deforma apreciablemente bajo compresión 19. En cuarto lugar, este protocolo evita daños irreversibles en los tejidos. En los experimentos publicados anteriormente, no se observaron cambios en las propiedades mecánicas de las lentes de ratón durante la carga de repetición, lo que sugiere que este método no dañar la lente 19. Cuando mecánicamente probar las lentes de una especie diferente o lentes de mutantes, pruebas piloto se deben hacer para determinar la carga máxima necesaria para la deformación máxima repitiendo los pasos 2.8 a 2.10 y la comparación de las curvas de tensión de carga, diámetros de lente y los volúmenes de lente entre la primera y segunda cargando. Por último, este método proporciona una medición empírica de la rigidez o f toda la lente y no puede diferenciar las contribuciones de los diferentes tipos de células (células epiteliales, fibras corticales, fibras nucleares) y la cápsula de la lente con las propiedades mecánicas de todo el lente.
Las cepas axiales y ecuatoriales se representan aquí como funciones de la carga impuesta. Estudios anteriores han cuantificado rigidez lente ratón 19,21, la resistencia 21 o el cambio de diámetro 18 a la carga aplicada. Strain es una cantidad adimensional que permite la comparación directa entre las lentes de diferentes tamaños. Tenga en cuenta que la extensión ecuatorial (cepa positiva) se produce simultáneamente con la compresión axial aplicada (tensión negativa) debido a la conservación del volumen objetivo (es decir, el efecto de Poisson). Sin embargo, las cepas ecuatoriales observados eran mucho más pequeños en magnitud absoluta de las cepas axiales, lo que indica que este método tiene menos resolución para detectar pequeños cambios en la tensión ecuatorial, en comparación con la deformación axial.
nt "> En resumen, este método simple con un dispositivo de fácil montaje para la medición de la rigidez de la lente del ratón se puede aplicar en general y ampliamente en la investigación de la lente para entender mejor cómo las mutaciones en proteínas, patologías y / o el envejecimiento afecta a la rigidez de la lente. Mientras que las lentes de ratón no lo hacen acomodar, este método todavía se puede dilucidar las proteínas y modificaciones relacionadas con la edad que contribuyen al aumento de la rigidez de la lente, y potencialmente contribuir al desarrollo de nuevos conocimientos nuevos tratamientos para la presbicia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
