This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
imaging super-resolução óptica com microscopia de iluminação estruturada (SIM) é uma tecnologia-chave para a visualização de processos a nível molecular na ciências biomédicas e químicas. Embora os sistemas SIM comerciais estão disponíveis, os sistemas que são projetados em laboratório pode superar sistemas comerciais, este último normalmente concebidos para facilidade de uso e aplicações de uso geral, tanto em termos de fidelidade de imagem e velocidade. Este artigo apresenta um guia detalhado para a construção de um sistema SIM que utiliza iluminação reflexão interna total (TIR) e é capaz de imagem em até 10 Hz em três cores em uma resolução chegando a 100 nm. Devido à combinação de SIM e TIRF, o sistema proporciona um melhor contraste de imagem do que as tecnologias rivais. Para atingir estas especificações, vários elementos ópticos são utilizados para permitir controle automatizado sobre a estrutura de estado de polarização e espacial da luz de iluminação para todos wav excitação disponíveiselengths. Detalhes completos sobre a implementação de hardware e controle são dadas para conseguir a sincronização entre a geração de luz de excitação teste padrão, comprimento de onda, estado de polarização, e controle da câmera com ênfase na obtenção de taxa de quadros máxima de aquisição. Um protocolo passo-a-passo para o alinhamento e a calibração do sistema é apresentado e a melhoria resolução alcançável é validado em amostras de teste ideal. A capacidade de imagiologia super-resolução de taxa de vídeo é demonstrada com células vivas.
Ao longo da última meia década, a microscopia de super-resolução amadureceu e mudou-se de laboratórios ópticos especializados para as mãos do biólogo. Existem soluções microscópio comerciais para os três principais variantes para alcançar óptico super-resolução: microscopia molécula localização única (SMLM), estimulado microscopia de esgotamento de emissão (STED), e microscopia de iluminação estruturada (SIM) 1,2. SMLM tais como microscopia fotoativados localização (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM) têm sido as técnicas mais populares, em grande parte devido à simplicidade da configuração óptica e a promessa de alta resolução espacial, prontamente abaixo de 20 nm. No entanto microscopia de super-resolução via única molécula de localização vem com uma intrínseca trade-off: o atingível resolução espacial é dependente de acumular um número suficiente de localizações fluoróforo individuais, limitando assim a resolução temporal. processo dinâmico de imagemES em células vivas, por conseguinte, torna-se problemático como uma amostra deve adequadamente o movimento da estrutura de interesse para evitar artefactos de movimento ao mesmo tempo que a aquisição de acontecimentos de localização suficientes em que o tempo para reconstruir uma imagem. A fim de atender a esses requisitos, demonstrações ao vivo SMLM celular têm obtido o necessário aumento das taxas de fluoróforo photoswitching, aumentando muito o poder de excitação, e isso leva por sua vez a fototoxicidade e estresse oxidativo, limitando assim o tempo de sobrevivência de amostra e relevância biológica 3.
A clara vantagem de STED sobre ambos SIM e SMLM é que ele pode imagem com super-resolução em amostras de espessura, por exemplo resolução lateral de cerca de 60 nm foi conseguida em fatias de cérebro organotípicas em profundidades de até 120 mm 4. Imagiologia em tais profundidades com implementações objetivos únicos de SMLM ou SIM é inviável, mas torna-se possível com qualquer folha de luz única molécula ou estrutura folha de luz microscopy 5. -Taxa de Vídeo STED também tem sido demonstradas e utilizadas para mapear a mobilidade das vesículas sinápticas, embora até agora este tem sido limitada a imagiologia de pequenos campos de visão 6.
Para aplicações em biologia celular e reacções auto-montagem moleculares 7 – 12 que exigem imagens com alta resolução temporal ao longo de muitos pontos de tempo, microscopia de iluminação estruturada (SIM) pode ser bem adequada, uma vez que não é dependente das propriedades fotofísicas de um marcador fluorescente particular, sondar. Apesar dessa vantagem inerente do SIM, até agora a sua utilização tem sido principalmente confinada à imagem latente células fixas ou processos lentos. Isto é devido às limitações dos sistemas de SIM comercialmente disponíveis: a taxa de quadros aquisição destes instrumentos foi limitada pela velocidade de rotação das grades utilizadas para gerar os padrões de iluminação sinusoidais necessários, bem como a manutenção da polarização óptica. A mais nova geração de SIM comercialinstrumentos são capazes de imagem rápido, mas eles são proibitivamente caro para todos, mas as instalações de imagiologia centrais.
Este protocolo apresenta um guia para a construção de um sistema flexível SIM para imagiologia de processos rápidos em amostras finas e perto da superfície basal de células vivas. Emprega total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) para gerar um padrão de iluminação que penetra no mais profundo do que cerca de 150 nm na amostra 13, que reduz drasticamente o fora de sinal de fundo do foco. A idéia de combinar SIM com TIRF é quase tão antiga como SIM-se 14, mas não foi realizado experimentalmente antes de 2006 15. A primeira in vivo imagens obtidas com TIRF-SIM foram relatados em 2009 16 atingindo taxas de quadro de 11 Hz para visualizar tubulina e kinesin dinâmica, e dois sistemas TIRF-SIM cores foram apresentados 17,18. Mais recentemente, uma guia para a construção e utilização de uma única cor de dois feixes s SIMistema foi apresentado com frame-rate de até 18 Hz 19,20.
O set-up aqui apresentado é capaz de imagem de super-resolução SIM a 20 Hz em três cores, dois dos quais podem ser operados em TIRF-SIM. Todo o sistema é construído em torno de um corpo do microscópio invertido e usa uma fase de tradução XY motorizada com um palco z-atuado piezo. Para gerar os padrões de excitação sinusoidal necessários para TIRF-SIM, o sistema apresentado utiliza um modulador de luz espacial ferroeléctrica (SLM). padrões binários de grelha são mostradas na SLM e as ordens de difracção de ± 1 resultantes são filtrados, e retransmitida focado no anel TIR da lente objectiva. Os deslocamentos e as rotações dos gradeamentos de fase necessários são aplicadas mudando a imagem exibida SLM. Este protocolo descreve como construir e alinhar um tal caminho de excitação, detalha o alinhamento do caminho de emissão, e apresenta amostras de ensaio para garantir um alinhamento óptimo. É também des os secretários questões e desafios específicos para alta velocidade TIRF-SIM em matéria de controlo de polarização e sincronização de componentes.
Considerações de design e Restrições
Antes de montar o sistema TIRF-SIM apresentados neste protocolo, existem várias restrições de design a considerar que determinam a escolha de componentes ópticos. Todas as abreviaturas de componentes ópticos referem à Figura 1.
Spatial Luz modulador (SLM)
A ferroelétrico SLM binário é utilizado nesta configuração, uma vez que é capaz de comutação padrão de sub-milissegundo. SLMs nemáticos em tons de cinza podem ser usados, mas estes oferecem bastante reduzido os tempos de comutação. Cada ligado ou desligado do pixel binário numa fase SLM vai conferir deslocamento para a frente de onda plana incidente, quer uma fase π ou 0, por conseguinte, se um padrão de grelha periódica é exibido na SLM ele irá operar como uma grade de difracção de fase.
ent "> reflexão interna total (TIR) Para atingir TIR e produzir um campo evanescente, o ângulo de incidência dos feixes de excitação na interface vidro-amostra deve ser maior do que o ângulo crítico . Isso define o ângulo mínimo incidente necessário, e, portanto, também o espaçamento máximo, ou período, do padrão de iluminação evanescente. O ângulo máximo de incidente
(O ângulo de aceitação) é limitado pela abertura numérica (NA) da lente objectiva, que pode ser calculada a partir da definição
. Isto determina o padrão de espaçamento mínimo realizável de acordo com a fórmula Abbe
que liga NA e comprimento de onda
para o padrão de espaçamento mínimo <imgalt = "Equação" src = "/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />. Na prática, uma imersão em óleo 1,49 NA TIRF objectivo produz um ângulo de incidência máximo de cerca de 79 ° e um período mínimo de padrão na amostra de 164 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Estes dois ângulos definem um anel em volta da abertura da objectiva sobre os quais o instrumento atinge TIR iluminação (ou seja. O anel TIR), e em que os focos duas excitação deve ser posicionado com precisão e precisamente rodado para gerar cada padrão de iluminação.
Reconstrução de imagens TIRF-SIM exige a aquisição de um mínimo de três deslocamentos de fase por rotação padrão, portanto, o período padrão de SLM deve ser divisível por 3 (ver Figura 1). Por exemplo, um período de 9 pixels para iluminação 488 nm e 12 pixels para 640 nm iluminação. Para uma discussão abrangente de design padrão SLM, incluindo otimização de sub-pixel de padrão de espaçamento usando grades de cisalhamento, Ver o trabalho anterior de Kner et al. 16 e Lu-Walther et al. 20 A posição dos dois focos de excitação deve estar dentro do anel TIR para todos os comprimentos de onda, no entanto, o ângulo de difracção dos ± 1 ordens da SLM é de comprimento de onda dependente. Para SIM padrão, imagem multicolor pode ser obtida através da optimização do período de reticulação para o comprimento de onda mais longo, e tolerar uma perda de desempenho para os canais mais curtos. Para TIRF-SIM no entanto, optimizando para um comprimento de onda significa que o outro comprimento de onda deixa de focos dentro do anel são TIR. Por exemplo, utilizando um período de reticulação de 9 pixels é suficiente para proporcionar TIRF para 488 nm, como os focos são a 95% do diâmetro da abertura para trás e para dentro do anel TIR, mas para 640 nm, este período seria posicionar o focos fora a abertura. Por esta razão diferentes espaçamentos padrão de pixel deve ser utilizado para cada comprimento de onda de excitação.
O alinhamento do caminho de excitação TIRF-SIMé extremamente sensível a pequenas mudanças na posição do espelho dicróico (DM4 na Figura 1) no corpo do microscópio, muito mais assim do que no SIM convencional. Utilização de uma torreta rotativa cubo de filtro não é recomendado, em vez disso usar um único, espelho dicróico multi-banda, que é mantido numa posição fixa e concebidos especificamente para os comprimentos de onda de excitação utilizados. É essencial que apenas a maior qualidade espelhos dicróicos são utilizados. Estes exigem substratos grossos de pelo menos 3 mm, e são muitas vezes designado como "plano de imagem" pelos fabricantes. Todos os outros substratos levar a aberração intolerável e degradação da imagem em TIRF-SIM.
Controle de polarização
Para alcançar TIRF-SIM é essencial rodar o estado de polarização da luz de excitação, em sincronia com o padrão de iluminação de modo a que ele permanece azimutais polarizada no plano da pupila objectivo em relação ao eixo óptico (isto é,. s-polarizada). O alinhamento das ópticas de controlo de polarização dependerá do elemento óptico específico empregue, por exemplo uma célula de Pockels 21, ou uma placa de meia onda em uma etapa de rotação motorizada 22. Neste protocolo um retardador variável de cristal líquido personalizado (LCVR) é usado, projetado para fornecer de onda completa (2π) retardance sobre a faixa de comprimento de onda 488-640 nm, uma vez que permite a comutação rápida (~ ms). Se usar um retardador de cristal líquido é essencial a utilização de um componente de alta qualidade: componentes padrão geralmente não são suficientemente estáveis para dar um retardamento constante ao longo da duração do tempo de exposição da câmara que leva a uma desfocagem para fora do padrão de iluminação e de baixo contraste de modulação . retardadores de cristal líquido são também fortemente dependente da temperatura e exigem construído no controle de temperatura.
sincronização
Os lasers deve ser sincronizado com o SLM. SLMs ferroelétricos binários são equilibrados internamente por switching entre um estado ligado e desligado do estado. Os pixels só agem placas como meio de onda em qualquer seu estado ligado ou desligado, mas não durante o tempo entre quadros de comutação. Portanto, os lasers só deve ser ligado durante estados on / off através do LED Activar sinal do SLM para evitar uma redução em contraste padrão devido ao estado intermediário dos pixels. Um modulador acústico-óptico (OMA) pode, alternativamente, ser utilizado como um obturador rápido, se os lasers não podem ser modulados digitalmente.
Escolha de lentes
Com base nestes constrangimentos, o demagnification necessária do plano SLM sobre o plano da amostra para produzir os padrões de iluminação pretendida pode ser determinada. Isto permite o cálculo das distâncias focais de duas lentes L3 e L4 no telescópio relé imagem e a lente de excitação condensador L5. Neste sistema um / imersão em óleo 1.49NA lente objectiva 100X é usado com 488 nm de excitação e 640 nm, consequentemente, utiliza comprimentos focais de 300 e 140 milímetrospara L4, L3, e 300 mm de L5, dando um total de demagnification 357X, equivalente a um tamanho de pixel de 38 nm SLM no plano da amostra. Usando esta combinação de lentes, SLM ralar para 9 períodos de iluminação 488 nm e 12 pixels para dar 640 nm padrão de espaçamentos 172 e 229 nm para a amostra, que corresponde a ângulos de incidência de 70 ° e 67 ° respectivamente. Para uma interface de água de vidro, o ângulo crítico é de 61 °, e é independente do comprimento de onda, por conseguinte, estes dois espaçamentos padrão permitir excitação TIRF para ambos os comprimentos de onda. Uma lente objectiva equipado com um colar de correcção é útil para a correcção das aberrações esféricas introduzidos por variações na espessura da lamela, ou se a operar a 37 ° C.
Reconstrução imagem
Uma vez que os dados em bruto SIM tenha sido adquirido, é uma questão de esforço computacional para gerar imagens de super-resolvido em um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, o padrão de iluminação tem de ser determinado paracada imagem e em segundo lugar, os componentes do espectro SIM deve ser separada e recombinadas de forma adequada como para dobrar o suporte OTF eficaz (ver Figura 6, inserções).
O conhecimento preciso dos padrões de iluminação projectados é primordial, como os componentes de frequência super-resolvido tem que ser não misturados com a maior precisão possível para evitar artefactos causados por as partes residuais de componentes sobrepostos. Nós determinamos o padrão de iluminação parâmetros a posteriori a partir dos dados de imagem em bruto seguindo o procedimento introduzido por Gustafsson et al. 23 Em suma, um conjunto de parâmetros de iluminação que descreve uma senóide bidimensional normalizada tem de ser encontrado para cada um dos padrões de excitação
:
por este meio e
descrever o contraste da franja e do padrão na fase inicial de cada imagem individual m respectivamente. Os componentes do vector de onda,
e
, Só mudam com orientações diferentes
do padrão e pode ser assumida em contrário constante. Para determinar grosseiramente as componentes do vector de onda uma correlação cruzada dos espectros de imagem em bruto é realizada, o que é refinada através da aplicação de deslocamentos subpixel a uma das imagens interligado a optimizar a sobreposição. Isto é feito através de multiplicação de espaço-Real gradientes de fase
que induzem uma mudança subpixel na frefre–espaço. Note-se que é útil ter uma boa estimativa da onda-vectores antes da estimativa real padrão e esta pode ser encontrada por imagiologia de uma camada de cordão fluorescente.
Como o passo de fase entre os padrões é deslocado , Ou seja.
, A separação de componentes de frequência pode ser realizada por uma transformada de Fourier ao longo do eixo "fase". A fase mundial
e o contraste franja
pode então ser determinada usando regressão linear complexa de diferentes componentes. Os componentes individuais separadas são então combinadas através de um filtro de Wiener generalizado. Para uma descrição detalhada de ambos extração de parâmetros e implementação do filtro de Wiener generalizado nos referimos o leitor a Gustafssonet al. 23, onde o mesmo algoritmo é utilizado.
sistemas Custom-Built TIRF-SIM, tais como a configuração detalhado neste protocolo são capazes de imagem de super-resolução multicolor em alta velocidade em comparação com microscópios comercialmente disponíveis. A vantagem inerente de SIM, como uma técnica de super-resolução é que a resolução temporal não é limitada pelos fotofísica do fluoróforo, em comparação com outros métodos tais como microscopia de molécula única localização (SMLM) ou métodos de verificação de pontos, tais como microscopia de depleção de emissão estimulada ( STED). Ao contrário dessas outras técnicas, SIM não requer fluoróforos foto induzida ou esgotáveis modo imagem multicolor é simples. sistemas TIRF-SIM não, tais como a óptica de seccionamento SIM e multifocal SIM geralmente pode conseguir melhorar a resolução de 1,7 vezes ou menos, na prática, ao contrário do factor de 2 a melhoria aqui relatado, e sistemas comerciais são também muitas vezes mais lenta e menos flexível do que o sistema apresentado neste protocolo.
"> As duas principais dificuldades na aplicação desta técnica são, em primeiro lugar a necessidade de posicionamento preciso das seis vigas SIM dentro da zona TIR de abertura costas do objetivo, que requer um tempo trabalhoso e demorado procedimento de alinhamento óptico. Em segundo lugar, para produzir alto contraste padrão na amostra, a rotação de polarização é essencial. para sistemas de baixa nA 2D-SIM, rotação de polarização pode ser evitado pela escolha cuidadosa da orientação de polarização linear, mas isso torna-se impossível para TIRF SIM-25. para imagem multicolor de alta velocidade, eletro- controle de polarização óptica é necessário e isso aumenta a complexidade e o custo do sistema.Limitações da técnica
TIRF-SIM, como TIRF convencional, é, naturalmente, limitada a observação de estruturas e processos localizados na membrana celular basal, que pode ser iluminada por a profundidade de penetração de 150-200 nm do campo evanescente biológicos. EnquantoSIM é frequentemente citado como sendo menos photodamaging de células do que qualquer um ou STED SMLM, duplicação resolução lateral ainda faz aumentar o número necessário de fótons por, pelo menos, 4 vezes em comparação com 5 TIRF microscopia convencional. Para geração de imagens em altas taxas de quadros com tempos de exposições curtas, este aumento de fótons exige uso de aumento da intensidade de iluminação. Embora qualquer fluoróforo pode ser usado para geração de imagens de amostras SIM móveis fixos ou lentos, proteínas fluorescentes de alto brilho ou próxima geração de corantes sintéticos com fotoestabilidade melhorada são recomendados para imagens de células vivas.
Embora esta aplicação é capaz de imagiologia de uma única cor em taxas de quadros SIM em excesso de 20 Hz, a imagem multicolor no sistema apresentado é limitada pelo tempo de comutação do filtro de emissão de roda motorizada. Devido ao grande tamanho do chip câmara scmos, o uso de um filtro de emissão de banda múltipla e separadoras de imagem óptica seria possível e permitir i simultâneamaging com múltiplos comprimentos de onda, sem qualquer penalidade na velocidade. Outra possibilidade seria a alternância das diferentes lasers de excitação e usar um filtro de entalhe de banda múltipla para rejeitar a luz de excitação. O uso de um SLM ferroeléctrica binário nesta aplicação também não é óptima. A eficiência de difracção de tal SLM é muito baixo, então a maior parte da luz incidente é no reflexo de ordem zero, que é filtrado para fora por a máscara espacial. Para aplicações que exigem muito altas taxas de quadros, a velocidade de imagem é, portanto, limitada pelo poder dos diodos de laser de saída. O SLM também introduz algumas elipticidade na polarização para comprimentos de onda de distância do comprimento de onda de 550 nm projeto onde os pixels não funcionam placas meia onda como ideais. Embora isso poderia ser compensado através da utilização de uma LCVR adicional, a solução ideal pode ser o uso de um dispositivo de micro-espelho digitais (DMD) como um gerador de padrão.
possíveis modificações
O prese configuraçãonted aqui é flexível e mais facilmente modificado do que os instrumentos comerciais para que outras modalidades de imagem, tais como 3D-SIM, rápida 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) e SIM não-linear (NL-SIM) podem ser implementadas 21,34,35.
2D-SIM pode ser bem adequado para imagiologia relativamente plana, move-se rapidamente estruturas, tais como o retículo endoplasmático periférica. O ER periférica é mais profundo dentro da célula que pode ser iluminado usando um campo evanescente TIRF, mas devido à sua estrutura plana pode ser fotografada usando padrão 2D-SIM com insignificante fundo fora de foco. Além disso, o uso de melhores algoritmos de reconstrução de corte ópticas para suprimir fora-de-foco de luz estender o uso do 2D-SIM para opticamente amostras de espessura, embora onde duplicação resolução axial não é necessária 21.
Em MSIM, a amostra é iluminada por uma rede esparsa de excitação focos 36. Esta modalidade pode ser implementado simplesmente removendo a máscara espacial (SM) E substituindo-o por um polarizador. O SLM agora funciona como um modulador de amplitude. As grelhas SIM binários exibidos na SLM pode ser substituído por uma estrutura de pontos em 2D, com o tamanho dos pontos escolhidos para ser igual ao tamanho de um foco de difracção limitada no plano de imagem. Na Figura 7A, uma estrutura de 4 x 4 quadrados do pixel é exibido na SLM (inset) que quando demagnified sobre a amostra gera focos de difracção limitada de 150 x 150 mm, tendo em conta o tamanho do pixel SLM física de 13,62 | im. Os focos de excitação pode ser então traduzida pela mudança do padrão da rede em SLM e isto é repetido várias vezes a fim de iluminar a totalidade do campo de visão. As imagens são adquiridas para cada posição do padrão traduzida e a pilha é pós-processados para produzir uma imagem reconstruída com uma melhor resolução de até um fator de e reduziu fora-de-foco de luz em comparação com a imagem widefield equivalente30. Esta modalidade pode ser útil para imagiologia de amostras grossas, densos para os quais SIM padrão é inadequado, por exemplo, estruturas de baixo contraste, tais como os glóbulos vermelhos corados (Figura 7C), embora o tempo de aquisição é aumentada, devido ao grande número de quadros de matérias- requerido por campo de visão (neste caso n = 168).
Finalmente, a configuração pode ser modificada para permitir que seja alta-NA linear TIRF-SIM ou activação modelado não linear SIM (PA NL-SIM), tal como apresentado recentemente por Li et al., Através da utilização de uma 1,7 objectivo ou a adição de ultra NA de um laser de 405 nm fotoativação e otimização cuidadosa dos SLM padrões ralar 35.
Aplicações futuras
SIM ainda é uma técnica rápida evolução e muitas aplicações nas ciências da vida será habilitado no futuro. A velocidade, resolução e melhorias de contraste da técnica e a capacidade de utilizar padrão fluor�oros mean que, para bioimaging, SIM está definido para substituir muitos sistemas de microscopia convencional, tais como plataformas de campo confocal e largas. sistemas SIM comerciais já estão disponíveis hoje, com especificações técnicas pendentes, no entanto, eles estão além do alcance financeiro de muitos laboratórios de pesquisa, e, crucialmente, eles são inflexíveis de ser modificado e desenvolvido para implementar as mais recentes desenvolvimentos da investigação no campo. Eles também não têm a capacidade essencial para 'ser adaptado para o experimento na mão', muitas vezes um gargalo crítico na corte pesquisa de ciências biológicas borda. O sistema descrito aqui será particularmente adequado para estudar processos dinâmicos perto da superfície da célula, para estudos in vitro de sistemas bicamada reconstituídos, para estudar a química de superfície nos materiais e ciências físicas, por exemplo. de materiais 2D, e muitas outras aplicações.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Leverhulme, da Engenharia e Ciências Físicas Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [áruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] e do Conselho de Pesquisa Médica [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Agradecemos E. Avezov e M. Lu por transfecção do LifeAct-GFP e células citosólica-GFP, respectivamente, e W. Chen para a preparação da cultura de células HEK293. Agradecemos também K. O'Holleran para assistência com o design do microscópio, e L. Shao e R. Heintzmann para discussões e sugestões úteis.
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |