Culture in vitro de cellules épicardiques De Coeur souris embryonnaires
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Une grande quantité de données expérimentales ont montré que l'épicarde influence des étapes cruciales dans le développement cardiaque. Au cours du développement, le septum transversum donne lieu à un amas de cellules mésothéliales connu sous le nom proepicardium 1-4. Les cellules de la proepicardium migrent ensuite et l'enveloppe du myocarde formant l'épicarde. Par la suite, un sous-ensemble de cellules épicardiques subissent EMT donnant lieu à une population migratoire des cellules dérivées épicarde (EPDCs) qui envahissent la suite du myocarde. lignée génétique ainsi que rétroviral traçage des expériences ont démontré que EPDCs se différencient en diverses lignées, y compris les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les cellules endotheliales et des cardiomyocytes (le cas échéant). Par conséquent EPDCs contribuent de manière significative au développement de la vascularisation coronarienne et de l' architecture du myocarde 1,2,4-9. En outre, l'épicarde est essentiel pour le développement de la couche compacte ventriculaire 10-12. Pour exemple Gittenberger de Groot et al. , ont démontré que l' inhibition de l'excroissance du proepicardium conduit à un réseau de défauts tels qu'une mince myocarde, mise en boucle déficiente du coeur et la formation du septum interventriculaire anormale et par conséquent, une létalité embryonnaire 13. facteurs paracrines sécrétées par l'épicarde embryonnaire modulent la prolifération des cardiomyocytes et la différenciation. Conformément à cela, la suppression spécifique de l' épicarde des voies de signalisation comme l' acide rétinoïque (RA), les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) et Wnt / β-caténine a entraîné une croissance du myocarde défectueux et une létalité embryonnaire 14-16.
Bien que l'épicarde croyait être au repos dans les cœurs adultes, des études récentes ont montré que le programme de développement est réactivé dans l'épicarde après une lésion cardiaque 17,18. Lors de l'activation, les cellules subissent une prolifération rapide et EMT qui aboutissent à la formation EPDC. Ces cellules présentent l'Capacity se différencier en fibroblastes et des cellules musculaires lisses mais non cardiomyocytes ou des cellules endothéliales 18. En outre, les EPDCs sécrètent des facteurs pro-angiogéniques que l'aide dans la vascularisation de la zone lésée et faciliter ainsi la fonction cardiaque améliorée en réduisant la taille de l'infarctus. En raison de ces résultats, l'épicarde a gagné l'intérêt pour l'étude du développement cardio-vasculaire, la maladie et la régénération.
La technologie transgénique a révolutionné la recherche médicale dans le 21e siècle. À l'aide des technologies transgéniques, des modèles de souris malades mimant la condition humaine et pathophysiologique métaboliquement ont été développés avec succès. Cependant, l'étude du comportement des cellules épicardique dans ces mutants a été un défi principalement due à une létalité embryonnaire précoce. Considérant le rôle important que l'épicarde joue dans le développement cardiaque et la régénération, nous avons mis en place un système de culture in vitro pour epicardia de la sourisl cellules. Cette méthode permet la culture à long terme des cellules épicardiques et facilite l'étude détaillée des deux propriétés importantes de l'épicarde: sa capacité à migrer et à se différencier. Ventricules excisé de la souris peuvent être cultivées sur des gels de collagène qui peuvent être utilisés pour réaliser des dosages de migration. Être cultivé dans une matrice 3D qui reproduit la matrice extracellulaire riche en collagène de la couche épicardique mieux récapitule in vivo dans la physiologie cellulaire. En variante, elles peuvent être cultivées sur des lames de la chambre, afin d'établir une monocouche épicardique qui peut ensuite être utilisé pour une variété d'applications en aval. Cette monocouche peut être utilisé pour colorer les protéines des jonctions serrées qui fourniront un aperçu sur la capacité de l'épicarde à subir EMT qui est crucial pour la migration. En outre, des expériences de différenciation peuvent également être effectuées sur ces cellules. En outre, le profil d'expression génique peut être analysé par extraction de l'ARN à partir des cellules eteffectuer une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). Enfin, les monocouches peuvent également être traités avec des agents, suivie d'une analyse moléculaire pour tester les agents thérapeutiques potentiels. Mis ensemble, ce système de culture épicardique nous offre la possibilité de visualiser et de recueillir des données moléculaires qui favorise notre compréhension sur le développement épicardique.
Une autre caractéristique souhaitable de cette méthode est qu'elle est simple et aucune installation complexe est nécessaire. En bref, les embryons sont récoltés à E11.5 ou E12.5 suivant laquelle le cœur est excisée. Les ventricules sont ensuite cultivées soit sur un gel de collagène ou des diapositives de chambre. Ensuite, ces cellules peuvent être utilisées pour réaliser des expériences en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel de développer des techniques qui facilitent l'étude de l'épicarde pour répondre à l'importance croissante de l'épicarde dans le développement cardiaque et la régénération. Le système de culture épicardique représente des avantages importants pour la recherche épicardique.
Une autre façon d'isoler des cellules épicardiques consiste à utiliser un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Cette méthode repose sur l'utilisation de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de DUKE-NUS Graduate École de médecine de Singapour, Goh fondation et Singapour NRF bourse (NRF-NRFF2016-01) à Manvendra K. Singh.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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