Développement d'un fibrotique du foie Modèle induite de l'éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
En dépit de la capacité de régénération des hépatocytes remarquable 1, qui sont le principal type de foie de cellules parenchymales, l' insuffisance hépatique chronique affecte cette capacité, conduisant à une cellule progénitrice hépatique (HPC) de régénération -dépendante 2.
Des dommages au foie chronique provient principalement de l' abus d'alcool, le virus de l' hépatite C chronique (VHC) 3 et non-alcoolisées maladie du foie gras (NAFLD) 4. Elle conduit à une fibrose hépatique soutenue, qui est associée à l'accumulation de protéines de matrice extracellulaire (ECM). Persistance accumulation ECM déforme l' architecture hépatique intacte en formant un tissu de cicatrice fibreuse 5, ce qui entraîne par la suite dans la cirrhose avec une forte morbidité et la mortalité. De nombreuses tentatives ont été faites pour atténuer la réponse fibrotique principalement en se concentrant sur l' inhibition des cytokines et profibrogenic activés myofibroblastes 6. Ce dernier est principalement dérivé de cellules étoilées du foie (HSCs), les cellules non hépatiques parenchymateuses principaux responsables de la formation d' une cicatrice hépatique 4. Néanmoins, les thérapies régénératives qui stimulent les sources cellulaires endogènes, y compris les CAH pour régénérer les hépatocytes en présence d'insultes fibrogéniques soutenues attendent une enquête plus approfondie.
De nombreux modèles expérimentaux de la fibrose hépatique ont été décrits chez les mammifères. Injection répétitive de tétrachlorure de carbone (CCl 4) a été largement utilisé pour induire une fibrose du foie chez les souris et de rat modèles 7. Lorsqu'il est combiné avec un régime alimentaire riche en graisses (HF), l' alcool conduit à une régulation positive substantielle de l' expression du gène profibrogenic et la fibrose hépatique 8. Bien stéatose (accumulation de lipides) résulte de l' exposition aiguë à l'alcool, il rend le foie sensibles aux lésions hépatiques plus sévères 9.
Le poisson zèbre, Danio rerio, a émergé comme un système modèle vertébré précieux pour l' étude de la régénération. Bien qued' autres vertébrés inférieurs tels que les tritons et les axolotls ont une remarquable capacité de régénération, le poisson zèbre a des avantages par rapport aux autres systèmes de modèle en ce qui concerne les stratégies de manipulation génétique et de visualisation nécessaires pour manipuler régénérative potentiel des facteurs 10. Le poisson zèbre constitue également un modèle vertébré attrayant pour étudier une maladie hépatique alcoolique (ALD) par simple addition d'éthanol (EtOH) pour leur eau. L' exposition aiguë EtOH à zebrafish larvaire et adulte a causé la stéatose hépatique 11-13. Lorsque le poisson zèbre adulte a reçu une exposition de EtOH prolongée, le dépôt de collagène a été observée avec une régulation positive de gènes liés à la fibrose 14. Cependant, il existe un besoin pour le développement de modèles pour étudier la régénération du foie en réponse à l'EtOH comme un stimulant fibrogène.
Récemment, nous avons développé un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish 15. Nous avons combiné un système d'ablation génétique spécifique hépatocytes avec un traitement EtOH dans larvaire et adult poisson zèbre. Nous avons généré des deux lignées transgéniques, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 et Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, dans lequel E. coli nitroreductase (NTR) sont fusionnées au cyan et mCherry protéine fluorescente, respectivement, sous le contrôle de la protéine de liaison 10a, le foie de base (fabp10a) promoteur acide gras spécifiques des hépatocytes. Dans ce système, NTR convertit un métronidazole promédicament non toxique (MTZ) dans un ADN inter-brin agent de réticulation 16, induisant la mort explicite des hépatocytes. En utilisant ce modèle, nous avons démontré qu'une population de cellules hépatiques, qui sont sensibles à la signalisation Notch, converti en hépatocytes en la quasi-absence d'hépatocytes et dans l'excès de l'ECM. Nous avons désigné ces cellules comme CAH. En outre, à travers des écrans chimiques, nous avons identifié les petites activateurs de molécules de signalisation Wnt et des inhibiteurs de la signalisation Notch qui augmentent la régénération hépatocytaire dans le foie fibrotique. Therefore, notre modèle de foie fibrotique chez le poisson zèbre représente un système de criblage chimique superbe par rapport à culture- cellulaire ou d'un système de dépistage des mammifères à base. Il est un système in vivo avec des coûts importants et des avantages de gain de temps. Nous décrivons ici les procédures détaillées pour établir un modèle de foie fibrotique induit EtOH et pour réaliser des écrans chimiques en utilisant ce modèle chez le poisson zèbre. De plus, des analyses de temps cours ont été réalisées pour étudier la façon dont la régénération des hépatocytes se produit dans le foie fibrotique. Ce protocole fournira un outil précieux pour étudier les mécanismes et les stratégies de renforcement de régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons observé HPC à médiation par régénération des hépatocytes dans le foie se rétablissent EtOH / MTZ traités, ce qui suggère que, même en présence d'une quantité importante de protéines de la MEC, notamment le type de collagène fibrillaire, les CAH conservent leur aptitude à se régénérer en hépatocytes. Le MTZ que le traitement n'a pas augmenté le dépôt de protéines ECM de manière significative, alors que le seul traitement EtOH n'a pas induit l' activation du HPC 15….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du GTEC (2731336 et 1411318), le NIH (K01DK081351) et la NSF (1.354.837) au SHC Nous remercions Alem Giorgis pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
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