Développement d'un fibrotique du foie Modèle induite de l'éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Summary

Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.

Abstract

Une fibrose hépatique soutenue avec poursuite de l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) entraîne la perte de compétence cellulaire du foie, conduisant à une cirrhose avec dysfonctionnement hépatocellulaire. Parmi les multiples agressions hépatiques, l’abus d’alcool peut entraîner d’importants problèmes de santé, notamment une insuffisance hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Néanmoins, l’identité des sources cellulaires endogènes qui régénèrent les hépatocytes en réponse à l’alcool n’a pas été correctement étudiée. De plus, peu d’études ont modélisé efficacement la régénération des hépatocytes sur les lésions induites par l’alcool. Nous avons récemment rapporté l’établissement d’un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol (EtOH) chez le poisson zèbre dans lequel les cellules progénitrices hépatiques (HPC) ont donné naissance à des hépatocytes lors d’une perte presque complète d’hépatocytes en présence d’un stimulus fibrogène. De plus, grâce à des criblages chimiques utilisant ce modèle, nous avons identifié plusieurs petites molécules qui améliorent la régénération des hépatocytes. Nous décrivons ici en détail les procédures pour développer un modèle de foie fibrotique induit par l’EtOH et pour effectuer des criblages chimiques à l’aide de ce modèle chez le poisson zèbre. Ce protocole sera un outil essentiel pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique. De plus, ces méthodes faciliteront la découverte potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies chroniques du foie in vivo.

Introduction

En dépit de la capacité de régénération des hépatocytes remarquable ^1, qui sont le principal type de foie de cellules parenchymales, l' insuffisance hépatique chronique affecte cette capacité, conduisant à une cellule progénitrice hépatique (HPC) de régénération -dépendante ^2.

Des dommages au foie chronique provient principalement de l' abus d'alcool, le virus de l' hépatite C chronique (VHC) ³ et non-alcoolisées maladie du foie gras (NAFLD) ^4. Elle conduit à une fibrose hépatique soutenue, qui est associée à l'accumulation de protéines de matrice extracellulaire (ECM). Persi....

Protocol

Zebrafish ont été soulevées et élevé en utilisant un protocole standard qui répond aux critères du National Institutes of Health et approuvés par le Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Préparation des solutions

1. Préparer l'eau d'œuf de 20 L (utilisés de façon interchangeable avec «moyen d'embryons ') pour maintenir le poisson zèbre embryonnaire / larvaire. Dissoudre 1,5 g de CaSO ₄ et 6 g de sel marin instantané de la mer dans 250 ml d' eau distillée. Verser dans une bonbonne remplie de 20 L d'eau distillée et agiter.
2. Préparer 1 L (PTU) solution mère-2-thiou....

Results

La figure 1 montre le développement d'un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish larvaire. Pour optimiser un protocole pour exposer les larves du poisson zèbre, EtOH, nous avons d'abord évalué la toxicité EtOH. 2,5 jours post-fécondation (dpf) larves ont été exposées à une concentration EtOH 1%, 1,5%, ou 2% pendant 24 heures suivie d'une concurrente 24 h EtOH traitement / MTZ. L'exposition à 2% d'EtOH a provoqué une mortalité élevée, tandis que presque toutes les.......

Discussion

Nous avons observé HPC à médiation par régénération des hépatocytes dans le foie se rétablissent EtOH / MTZ traités, ce qui suggère que, même en présence d'une quantité importante de protéines de la MEC, notamment le type de collagène fibrillaire, les CAH conservent leur aptitude à se régénérer en hépatocytes. Le MTZ que le traitement n'a pas augmenté le dépôt de protéines ECM de manière significative, alors que le seul traitement EtOH n'a pas induit l' activation du HPC ^15. En utilisant le tr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulfate de calcium hémihydraté (CaSO4)	Acros	AC385355000
Sulfate de magnésium (MgSO4)	EMD	MX0075
1,4-Pipérazinediethanesulfonic (PIPES)	Sigma-Aldrich	P6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N&prime ;,N&prime ; Acide -tétraacétique (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldéhyde	Fisher Scientific	F79-500
Métronidazole (MTZ)	Sigma-Aldrich	M3761
1-phényl-2-thiourée (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
3-amino benzoïque ester éthylique (Tricaïne)	Sigma-Aldrich	A5040
Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Amresco	E404	Dissoudre un comprimé avec 100 ml d’eau distillée
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Albumine sérique bovine	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
à faible point de fusion agarose  ;	Amresco	BP165
Bibliothèque de composés de signalisation de cellules souches	Selleck Chemicals	L2100	10  ; stock mM dans DMSO
ActiProbe-1K Bibliothèque	Timtec	ActiProbe-1K	10  ; stock mM dans DMSO
SB 415286	Selleck Chemicals	S2729	Dissoudre avec le DMSO à 10  ; mM
CHIR-99021	Selleck Chemicals	S2924	Dissoudre avec du DMSO à 10  ; Anticorps
anti-collagène I	mM Abcam	ab23730	Utilisation à 1:100 pour l’immunomarquage, réagit avec les poissons
AlexaFluor 647 Donkey anti-lapin IgG (H+L)	Sondes moléculaires	A31573	Utilisation à 1:200 pour l’immunocoloration
Milieux de montage (Vectorshield)	Vector Laboratories	H-1400
100 mm Boîte de Pétri	VWR	25384-088
24 puits plaque	VWR	10062-896
Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Dumont #55
Lame en verre	VWR	48312-003	75x25 mm
Verre de couverture	VWR	48366-045	18 mm
Pellicule plastique	Fisher Scientific	22305654
Feuille d’aluminium	Fisher Scientific	1213100
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Vibrotome	Leica	VT1000 S
Stéréomicroscope	Leica	M80
Microscope épifluorescent	Leica	M205 FA
Microscope Confocol	Zeiss	LSM700