Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro
Summary
Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.
Abstract
De células enteras de grabación de patch-clamp es una técnica electrofisiológica que permite el estudio de las propiedades eléctricas de una parte sustancial de la neurona. En esta configuración, la micropipeta está en estrecho contacto con la membrana de la célula, lo que impide la fuga de corriente y por lo tanto proporciona mediciones de corriente iónica más preciso que el método de grabación electrodo afilado intracelular utilizado anteriormente. Clásicamente, la grabación de célula entera se puede realizar en las neuronas en varios tipos de preparaciones, incluidos los modelos de cultivo celular, las neuronas disociadas, neuronas en rodajas de cerebro, y en animales anestesiados o despierto intactas. En resumen, esta técnica ha contribuido enormemente a la comprensión de las propiedades biofísicas pasivos y activos de las células excitables. Una ventaja principal de esta técnica es que proporciona información sobre la forma específica manipulaciones (por ejemplo, farmacológica, experimentador inducida por plasticidad) pueden alterar las funciones neuronales específicos o channels, en tiempo real. Además, la apertura significativa de la membrana de plasma permite que la solución de la pipeta interna para difundir libremente en el citoplasma, proporcionar medios para la introducción de medicamentos, por ejemplo, agonistas o antagonistas de las proteínas intracelulares específicas, y la manipulación de estos objetivos, sin alterar sus funciones en las células vecinas. En este artículo se centrará en la grabación de células enteras a cabo en las neuronas en rodajas de cerebro, una preparación que tiene la ventaja de grabación de las neuronas en los circuitos cerebrales relativamente bien conservados, es decir, en un contexto fisiológicamente relevante. En particular, cuando se combina con la farmacología adecuada, esta técnica es una poderosa herramienta que permite la identificación de neuroadaptaciones específicos que se produjeron después de cualquier tipo de experiencias, como el aprendizaje, la exposición a drogas de abuso, y el estrés. En resumen, las grabaciones de células enteras patch-clamp en rodajas de cerebro proporcionan medios para medir ex vivo de preparación de cambios de larga duraciónen las funciones neuronales que se han desarrollado en animales despiertos intactas.
Introduction
La técnica de patch-clamp, una técnica electrofisiológica que se ha desarrollado a finales de 1970 de 1,2, es una herramienta fundamental para el estudio de las funciones de los canales iónicos individuales o múltiples en el tejido vivo. Entre las diferentes configuraciones de parches que se pueden lograr, grabaciones de células enteras patch-clamp permiten el estudio del comportamiento eléctrico de una parte sustancial de la neurona. Clásicamente, esta técnica se realiza in vitro, ya sea en rodajas de cerebro, neuronas recién disociadas, o en modelos de cultivo celular 3. Cuando se realiza en las neuronas en rodajas de cerebro, esta técnica presenta varias ventajas. En particular: (i) las neuronas se registran en los circuitos cerebrales relativamente conservadas que hasta cierto punto, y en comparación con las preparaciones de cultivo celular, proporcionan un ambiente que es fisiológicamente relevante 3. Esto permite la captura temprana, o incluso el seguimiento en tiempo real, los eventos celulares y moleculares que son accionados por cualquier tipo de pharmacolog agudamanipulaciones iCal – una resolución temporal que no se puede lograr usando clásica en condiciones in vivo; (ii) la capacidad para identificar visualmente las regiones del cerebro en rodajas de cerebro permite una alta especificidad regional 3 tanto para la región del cerebro estudiada y para las neuronas específicas cuando expresan marcadores fluorescentes; (iii) el acceso al espacio intracelular de la célula mediante la apertura de una parte importante de la membrana plasmática (en contraste con la punción de la membrana con una micropipeta agudo para grabaciones intracelulares) 4. A su vez, esto permite que el contenido o concentración de iones específicos que componen la solución interna a ser modificados objetivos así moleculares o mecanismos celulares pueden estudiarse bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, al establecer la configuración de célula completa, cualquier agente farmacológico específico (por ejemplo, antagonistas) que se puede añadir a la micropipeta de grabación (parche pipeta) solución se difundirá directamente en el citoplasma y actuar en su putative dianas intracelulares sin alterar la función objetivo en las células vecinas. Además, en comparación con la grabación micropipeta agudo, la gran abertura en la punta del electrodo de patch clamp proporciona una resistencia más baja, menos ruido de la competencia, y por lo tanto un mejor acceso eléctrico al interior de la célula 4. Sin embargo, en cuenta que la gran abertura en la punta de la pipeta puede conducir a la diálisis de células, y por lo tanto la pérdida de la maquinaria molecular intracelular que puede ser crítica para la expresión de los fenómenos biológicos que están bajo 5,6 estudio. En este caso, las grabaciones de electrodos afilados pueden ser más adecuados. Este tipo de grabaciones requiere micropipetas con un poro que es mucho menor que los utilizados para las grabaciones de células enteras, evitando de este modo la mayor parte del intercambio iónico entre el espacio intracelular y la solución de la pipeta interna.
Cualquier forma de experiencia (aguda o crónica), incluyendo el aprendizaje de 7-10, la exposición a drogas de abuso 11,12, el estrés 13,14, etc., puede alterar diversos aspectos de la función neuronal en regiones específicas del cerebro. Debido a que estas alteraciones a menudo requieren tiempo para desarrollarse (horas o días), conjunto de células grabaciones en secciones de cerebro de animales que han sido sometidos a una experiencia específica permiten a los investigadores a identificar estos cambios. Básicamente, muchos (si no todos) los componentes que participan en funciones neuronales (por ejemplo, canales iónicos activados por ligando, canales de iones dependientes de voltaje, transportadores de neurotransmisores), y así la actividad y el comportamiento del circuito cerebro, puede ser alterado por la experiencia (dependiente de la experiencia plasticidad) 10,15-17. A nivel neuronal, la actividad circuito cerebral emerge de constantes interacciones entre sináptica (por ejemplo, la transmisión del glutamato) y los factores de excitabilidad celular intrínsecos (por ejemplo, canales de iones axosomato-dendríticas: sodio, Na +, potasio, K +, y calcio, Ca 2+ ). En condiciones específicas utilizando whole-células patch-clamp técnicas electrofisiológicas, alteraciones señal que se origina en concreto de los cambios en la excitabilidad intrínseca vs sináptica se puede aislar.
En la mayoría de los casos, la excitabilidad sináptica se evalúa mediante la técnica de fijación de voltaje de células enteras. Este modo de grabación permite la medición de las corrientes de iones [por ejemplo, mediada por los receptores del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ( receptores de AMPA) y los receptores de N-metil-D-aspártico (NMDA)] receptores a través de la membrana plasmática neuronal mientras se mantiene el potencial de membrana a una tensión de consigna. Aquí, los experimentadores utilizan las soluciones internas de micropipeta que contienen cesio (Cs +), un amplio bloqueantes de los canales de K + (factores intrínsecos excitabilidad clave). Al establecimiento de configuración de célula completa, la difusión de Cs + en el espacio intracelular bloqueará los canales de K +, y por lo tanto permitirá que tanto un relativamente eficiente espacio-clamp y preventilar influencia de los factores intrínsecos de excitabilidad en otras mediciones. Problemas de espacio-clamp, es decir, la dificultad de fijación de voltaje de células enteras, surgen cuando se graban las células de forma irregular (por ejemplo, neuronas), y en particular de neuronas con una vasta y compleja dendríticas cenador 18,19. Dado que los controles mal de fijación de voltaje somática voltaje en el árbol dendrítico de las neuronas, diversos aspectos de las señales eléctricas dendríticas en estudio se distorsionan de forma dendrítica dependiente de la distancia. Combinado con herramientas farmacológicas tales como la picrotoxina (ácido gamma-aminobutírico, GABA Un antagonista del receptor) o ácido quinurénico (amplio bloqueador de receptores de glutamato) disuelto en la solución extracelular (líquido cefalorraquídeo artificial, ACSF), esta técnica permite la medición de glutamato receptor-y corrientes de GABA A R-mediada respectivamente.
Por el contrario, la excitabilidad intrínseca se evalúa por lo general en el modo de grabación actual-clamp.A diferencia de la grabación de fijación de voltaje, este modo de grabación permite la medición de las variaciones en los potenciales de membrana inducidos por las corrientes de iones que fluyen a través de la membrana plasmática neuronal. Por lo general, la alteración de la excitabilidad intrínseca se evalúa a través de cambios en la capacidad de las neuronas para generar potenciales de acción, lo que requiere tanto de Na + y K + canales. Por lo tanto, al realizar grabaciones de corriente-clamp, micropipetas se llenan con una solución interna que contiene K + en lugar de Cs +. En combinación con los agentes farmacológicos que bloquean glutamato y GABA A las corrientes mediadas por el receptor disueltos en el ACSF, este diseño experimental permite la medición de la contribución de los factores intrínsecos (por ejemplo, los canales de K +) para la descarga neuronal sin ser contaminada por los posibles cambios en la excitabilidad sináptica factores.
En este artículo se describen los pasos básicos de procedimiento necesarias to (i) preparar rodajas de cerebro sanas; (Ii) lograr configuración de célula completa, y (iii) controlar parámetros básicos para evaluar sináptica y la excitabilidad intrínseca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el procedimiento básico para la realización de experimentos de células enteras patch-clamp en las neuronas en rodajas de cerebro. Sin embargo, la complejidad, el potencial y sensibilidad de esta técnica no pueden ser completamente descritos en este artículo. Aquí, hemos tratado de delinear los pasos más básicos y ponen de relieve los parámetros importantes que deben ser controlados para lograr conjunto de células grabaciones exitosas y rigurosos. Para el aprendizaje teórico, muchos lib…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por los fondos de inicio de UT Southwestern (SK).
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
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