ال<em> فيفو السابقين</em> الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids
Summary
هنا، يتم وصف بروتوكول لموسم الحصاد وصيانة وعلاج الماوس organoids الأمعاء الصغيرة مع الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) والمستوحدة الليستيريا، وكذلك التركيز على التعبير الجيني وتقنيات التطبيع المناسبة للبروتين.
Abstract
organoids الأمعاء الأساسي ونظام نموذجا قيما لديه القدرة على التأثير بشكل كبير على مجال علم المناعة المخاطية. ومع ذلك، فإن تعقيدات خصائص نمو عضوي الشكل تحمل محاذير كبيرة للمحقق. على وجه التحديد، وأنماط النمو في كل عضي الفردية تختلف اختلافا كبيرا، وخلق مجموعة متغايرة من الخلايا الظهارية في الثقافة. مع مثل هذه المحاذير، وممارسات زراعة الأنسجة المشتركة لا يمكن تطبيقها ببساطة إلى نظام عضوي الشكل نظرا لتعقيد الهيكل الخلوي. عد وتصفيح تستند فقط على عدد الخلايا، وهو أمر شائع للخلايا فصل على حدة، مثل خطوط الخلايا، ليست طريقة يمكن الاعتماد عليها لorganoids ما لم يتم تطبيق بعض تقنيات التطبيع. يتم تطبيع لمحتوى البروتين الكلي معقدة نظرا لمصفوفة البروتين المقيمين. ينبغي أن تؤخذ هذه الخصائص من حيث عدد الخلايا وشكل ونوع من الخلايا في الاعتبار عند تقييم يخدع يفرزخيمة من كتلة عضي. وقد تم إنشاء هذا البروتوكول لوضع الخطوط العريضة لإجراء بسيط للثقافة وعلاج organoids الأمعاء الصغيرة مع مسببات الأمراض الميكروبية والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs). كما يؤكد على تقنيات التطبيع التي يجب تطبيقها عندما يتم إجراء تحليل البروتين بعد هذا التحدي.
Introduction
القدرة على حصاد ولقد وصفت organoids الثقافة الابتدائية للالأمعاء الدقيقة والقولون والبنكرياس والكبد والدماغ ووالتقدم مثيرة ثيق لفهم أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية الظواهر لعلم الأحياء الأنسجة 1-5. وذكرت تقارير ان طرق الأولى واصفا الثقافة والمحافظة على organoids الأمعاء الصغيرة التي ساتو وآخرون من مختبر هانز كليفرز 1. قبل إلى هذا الأسلوب والحصاد والثقافة من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية أثبتت أن تكون محدودة وغير فعالة في الحفاظ على نمو الخلايا الظهارية. ومن بين أساليب تفكك النسيج عبر الحضانة مع الإنزيمات، مثل كولاجيناز وdispase، التي من شأنها أن تؤدي في نهاية المطاف إلى نمو الخلايا الليفية الأولية اختلط 6. هذه الشروط من شأنه أيضا أن الوقت محدود في الحفاظ على ثقافة الخلايا الظهارية. أن الحد الأدنى للا مكانة الخلايا الظهارية تشكيل، والخلايا الظهارية ستدخل موت الخلايا المبرمج بسببعدم وجود عوامل النمو المناسبة أو فقدان النزاهة الاتصال، ووصف anokis 7. وقد وفرت ظهور نظام الثقافة 3D عضوي الشكل وسيلة لثقافة الخلايا المعوية الأولية التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المعوية في ثقافة مستدامة 1. هذه organoids الظهارية لها مزايا أكثر من خطوط الخلايا كونها أنها تتألف من عدة خلايا متباينة، وتحاكي أفضل الجهاز أنها مشتقة من في الحي 8. عملية لفي نهاية المطاف "تنمو الأمعاء صغيرة في طبق" أثبت أنه أداة قيمة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء تحت محفزات مختلفة. التحقيق في التفاعل بين الخلايا المعوية الأولية مع الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الميكروبية (PAMPs) هو ذات الصلة في مجال علم المناعة وهذه الأنماط الجزيئية يمكن أن تنظم الاستجابات المتنوعة من كل من المضيف وميكروب 9. لا يمكن إلا أن المحققين استكشاف الآن هذه التفاعلات مع organoids الماوس، لكنهميمكن أن يكون مثقف من البشر فضلا 2. هذه التكنولوجيا لديه القدرة على تغيير كبير الطب الشخصي وأنه من المغري التكهن بشأن التقدم أن هذه التقنية سوف تجعل من الممكن في المستقبل القريب.
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول للثقافة، والتوسع، وعلاج organoids الأمعاء مع مجموعة متنوعة من المحفزات. ويمكن لهذه المحفزات وتتراوح في نهاية المطاف من اللقاحات، PAMPs البكتيرية ومسببات الأمراض الحية، الجهاز الهضمي (GI) وعلاجات السرطان. وقد تم تكييف العزلة وثقافة الماوس organoids الأمعاء من ساتو وآخرون. وعلى الرغم من أن هناك انحرافات بسيطة من الأسلوب الأصلي، والمنتج النهائي يجري عضي ثقافة لا تزال تحقق عند اتباع هذا البروتوكول. وتركز هذه الطريقة على وصف تقنية كافية لتطبيع السليم عند التعامل مع هياكل الخلية غير المتجانسة، والتي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند إجراء فحص على أساس خلية نبني مصفر.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثقافة وصيانة organoids المعوي هو الإجراء الذي يمكن أن يلم بها أي فرد مع تقنية كافية زراعة الأنسجة. هناك الدقيقة في الركض بالمقارنة مع تنامي الخلايا في أحادي الطبقة الأكثر تقليدية، ولكن هذه الدقيقة وليس من الصعب التغلب عليها. الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة تنطوي على أن تكون…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
