This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca 2+ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na +, Ca 2+ und K + -Kanäle und der Na + -Ca 2+ Exchanger) und die intrazelluläre Ca 2+ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca 2+ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca 2+ Veränderungen sind die Triggersignale von EC – Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca 2+ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca 2+ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca 2+ Handhabung und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.
Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens 1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na + Kanal, der durch Patch-Clamp – Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ – Ca 2+ -Kanälen (LTCC) und Ca 2+ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca 2+ -Freisetzung durch Ryanodin – Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca 2+ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca 2+ Ca 2+ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin – Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion 3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca 2+ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca 2+ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na + / Ca 2+ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca 2+ ATPase 1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca 2+ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung 1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 – Konten – 90% der cytosolischen Ca 2+ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen 1. Als solche anormalen Handhabung Ca 2+ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz 1-4 betrachtet.
<p class="jove_content"> In Wirklichkeit frei cytosolischen Ca 2+ , die Funktionen als der Bote in der EG – Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca 2+ und die Mehrheit der Ca 2+ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 + Puffer 5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca 2+ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran – Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. 5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 + Puffer 5,6,7. Weiterhin 2+ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca 2+ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca 2+ Transienten 7) und die Änderung in Ca 2+ Bindungs Ursache zusätzlicher "Freigabe" von freiem Ca 2+ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca 2+ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien 8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine sein, die myofilament Ca 2+ Pufferung und myofilament 2+ 8-10 Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine , die die Ca 2+ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 + Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca 2+ Transienten, abnormal Ca 2+ Freisetzung und Arrhythmien 8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca 2+ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca 2+ Ebenen zugeordnet gezeigt11, die wiederum 12 die Anfälligkeit der LTCC auf Ca 2+ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ein "aktives" Regulator der intrazellulären Ca 2+ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca 2+ zu analysieren Proteine für die gründliche Untersuchung von myocyte EG – Kopplung und die Herzfunktion Handhabung.Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca 2+ Profil, myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.
Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 + Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , di…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2013068067) finanziert unterstützt; von Brain Korea 21 Graduiertenprogramm des koreanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Technologie, Seoul National University Hospital, der koreanischen Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (Nr. 3420130290) und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).
Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
NaCl | Sigma | S9625 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
MgSO4 | Sigma | M5921 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
Protease | Sigma | P6911 | |
Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
MyoCam-S Power | IonOptix | ||
Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
CFA300 | |||
PMT400 | |||
Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
Compositions of Experimental Solutions | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
Collangenase Solution 1 | |||
Isolation Solution (30mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
Collangenase Solution 2 | |||
Isolation Solution (20mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
BSA solution | |||
Isolation Solution (40mL) | |||
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |