Myofilament 칼슘의 평가^{2 +} 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

심부전 및 심장 부정맥은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 그러나, 병에 걸린 마음의 병인과 심근 고장의 메커니즘은 완전히 명확 일이다. 최근 강력한 증거가 myofilament 칼슘 2 ⁺ 감도의 변화가 심장 근육 세포에서 세포 내 ^칼슘 항상성 및 이온 채널 활동에 영향을 미칠 것으로 보여, 건강하고 병에 걸린 마음에 심장 활동 전위과 수축을 담당하는 핵심 메커니즘. 사실, (예를 들어, 나 ^+, 칼슘 2 ^+와 K ⁺ 채널과 나 ⁺ -ca ²⁺ 기) 및 세포 내 칼슘 2 ⁺ 처리 단백질 (예., ryanodine 수용체와 칼슘을 심장 활동 전위를 기본 이온 채널의 활동 및 운송 근질 세망 (SERCA2a) 또는 phospholamban과 인산화)에서 ^{2 +} -ATPase 종래 evalu 측정된다심장 자극 – 수축 (EC) 커플 링의 기본 메커니즘을 먹었다. myofilament이 수축과 이완의 기능 부이고, myofilament ^칼슘 감도 근원 섬유 성능의 구현에 필수적인 반면, 멤브레인 및 세포 내 ^칼슘의 변화 모두 전기 활동은 EC 결합의 트리거 신호이다. 이 연구의 초점이 아닌 그럼에도 불구하고, 몇몇 연구는 심근의 기능 분석에 myofilament ^칼슘 감도를 통합합니다. 여기, 우리는 근절 단축 / 재 연장과의 Fura-오전 2시 (비율 계량 감지)와 쥐 마음에서 심장 근육 세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가를 사용하여 세포 내 ^칼슘 수준을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 주요 목적은 ^칼슘 감도 역학적 분석 EC 결합에서 고려되어야한다는 myofilament을 강조하는 것이다. 난의 종합 조사번역 및 치료 가치보다 효과적인 전략을 설계에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다 건강하고 병에 걸린 마음에서 심근 수축력의 기초 채널, 이온 수송, 세포 내 ^칼슘 처리 및 myofilament ^칼슘 감도에.

Introduction

여기 심장 수축 (EC) 결합 심근 즉, 심장의 수축 ^1,2- 함수의 기계적 특성을 분석하는 기본 방식이다. EC 커플 sarcolemmal이 이온 채널의 활성에 보조 막을 탈분극에 의해 개시된다 (예를 들어, 패치 클램프 기술을 통해 측정 할 수있는 전압 – 게이트 나 ^{+ 채널).} (나노 몰에서 nm의 세포질 ^칼슘 농도를 증가 ryanodine 수용체 (RyRs)를 통해 전압 게이트 L 형의 후속 활성화 칼슘은 ^{2 +} 채널 LTCCs를 통해 ²⁺ 유입이 칼슘의 대부분을 트리거 (LTCCs)과 칼슘 2 ⁺ 릴리스, )는 (μM) 수준을 마이크로합니다. 세포질 ^칼슘의 이러한 증가는 얇은 필라멘트에 트로포 닌 C (TNC)에 결합하는 ^{2 +} 칼슘을 촉진하고 이끌어 필라멘트 복합체의 구조적 변화를 액틴 – 미오신 상호 작용을 촉진하고 myocardi을 달성알은 ³ 수축. 반대로, 세포질 ^칼슘은 SR에서 칼슘 2 ⁺ -ATPase를 통해 근질 세망 (SR) (SERCA2a)로 다시 재 uptaken거나 나 ⁺ / ^칼슘 교환기 및 plasmalemmal를 통해 심근에서 압출 칼슘 2 ⁺ ATPase의 ^{1, 2.} 따라서, 세포질 칼슘의 감소는 ^{2 +} 액틴 – 미오신과 심근 이완 ^1-3의 분리의 결과로, 다시 원래 상태로 얇은 필라멘트의 구조적인 변화를 선동. 대부분의 포유 동물의 심장 세포 ¹ 세포질 ^칼슘 제거의 90 % – 이러한 방식에서, SERCA2a의 활성은 일반적으로 70를 차지하기 때문에 심근 완화의 속도를 결정하는데 고려된다. 등 LTCC, RyR 및 SERCA2a에 의해 같은 비정상적인 ^칼슘 처리로 병에 걸린 심장 ^1-4에서 장애인 수축과 이완의 기본 메커니즘을 고려하고있다.

<p class="jove_content"> 현실에서, ^{2 +} 총 세포 내 칼슘의 약 1 %에 대한 EC 커플 링 계정의 메신저와 ^칼슘의 대부분 같은 기능은 세포 내 칼슘 2 ⁺ 버퍼 ^5,6에 바인딩 무료 세포질 ^칼슘. 이는 다양한 ^칼슘 버퍼의 SR에 예를 들어, 막 인지질, ATP, 크레아틴 인산, 칼 모듈 린, parvalbumin, 근원 섬유 TNC, 미오신, SERCA2a 및 calsequestrin 심장 근육 세포에 풍부 사실이다. ^5,6,7. 그 중, SERCA2a 및 TNC가 지배적 인 칼슘 2 ⁺ 버퍼 ^{5,6,7입니다.} 또한, 칼슘 ^{2 +의} 버퍼 바인딩 트 동안 역동적 인 과정이며, 추가 원인을 결합 칼슘의 변화 ²⁺ (예를 들어, ^{2 +} 칼슘의 30 % ~ 50 %는 ^{2 +} 과도 ⁷ TNC에 결합 칼슘 동안 그것에서 해리) 진한 ²⁺ 세포 내 칼슘의 변화에, 세포질 무료 ^칼슘의 결과를 "해제"entration. 그 결과, 세포 내 ^칼슘 수준의 교란은 수축 기능 장애 및 부정맥 ^8,9의 전구체입니다 이상 myofilament의 움직임을 유도한다. (생리 및 병리 모두) 많은 요인 myofilament ^칼슘 버퍼링 및 myofilament ^칼슘 감도 ^{8-10 영향을} myofilament 단백질의 전사 후 변형의 원천이 될 수 있습니다. 최근에는 칼슘 2 ⁺ 과도, 비정상적인 칼슘 2 ⁺ 릴리스 및 부정맥 ^8의 일시 정지에 의존 증강을 유발, myofilament 단백질의 돌연변이가 ^칼슘 결합 친화 및 세포 내 ^칼슘 처리를 늘리는 것이보고되었다. 이 개념에 맞춰, 우리는 또한 높은 이완기 및 수축기 ^칼슘 수준과 연관된 신경 세포의 산화 질소 합성 효소의 업 규제 이차 고혈압 쥐의 마음이 myofilament ^칼슘 탈감작을 보여 주었다결과적으로, ^칼슘 의존적 불 활성화 ^(12)에 LTCC의 취약성을 증가 ^11. 따라서, myofilament ^칼슘 감도는 세포 내 ^칼슘 항상성 및 심근 수축 기능의 "활성"레귤레이터이다. 그것은 myofilament와 칼슘 사이의 상호 작용을 분석 할 필요가있다 ²⁺ 심근 EC 커플 링 및 심장 기능의 철저한 조사를 위해 단백질을 처리.

여기, 우리는 고립 된 심장 근육 세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 내 칼슘 2 ⁺ 프로필의 종합 분석, myofilament ^칼슘 감도 및 수축 새로운 메커니즘을 기본 심근 역학을 발굴합니다.

Protocol

프로토콜은 건강의 UN 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라입니다 (NIH 공개 번호 85-23, 1996 개정). 그것은 서울 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (IACUC 승인 번호 : SNU-101213-1)에 의해 승인되었다. 1. 버퍼 준비 (표 재료 및 장비) mm 단위 (실험 당일 신선한 분리 용액 300㎖를 준비 : 염화나트륨, 135의 KCl, 5.4;의 MgCl 2,</s…

Representative Results

LV의 근육 세포는 정상 및 고혈압 쥐의 마음에서 격리됩니다. 필드 자극에 응답 분명 줄무늬 (근섬유 분절을 대표하는) 안정 수축과 막대 모양의 근육 세포가 최적의 근육 세포로 간주하고 녹음 (그림 2A) 선택됩니다. F의 igure 2a에 도시 된 예에서의 Fura 오전 2시 좌심실 심근 수평 위치와 근세포는 기록 필드 최소 배경 영역의 대부분이 포함되어 차?…

Discussion

여기서 우리는 하나의 고립 된 심장 근세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가하기 위해 프로토콜을 설명하고이 전기 생리 특성과 함께 매개 변수, 세포 내 칼슘 2 ⁺ 과도 및 myofilament 역학 측정의 중요성을 강조한다. 하나 또는 두 개의 매개 변수의 녹음은 심장의 수축과 이완을 기본 메커니즘을 해명하지 않을 수 있기 때문입니다. 심근의 수축과 세포 내 칼슘 2 ⁺ 프로필 …

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM