The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
De bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB) is een van de drie plaatsen barrière tussen bloed en hersenen 1. De morfologische correlaat zijn de epitheelcellen van de choroid plexus (CP) 2,3, een endotheel-epitheliale convoluut, die sterk gevasculariseerd en in de ventrikels. De CP dient om de cerebrospinale vloeistof (CSF) te produceren en om deze uit het bloed te scheiden. Om de barrière functie te bereiken, de CP epitheliale cellen vertonen een lage pinocytotic activiteit uitdrukken specifieke transporters, en worden dicht verbonden door een continu netwerk van krappe kruispunten (TJs) 2,3.
Menselijke choroid plexus papilloma (HIBCPP) cellen, afgeleid van een kwaadaardige choroid plexus papilloom van een Japanse vrouw 4, werden gebruikt om een functionele in vitro model van de BCSFB construeren. HIBCPP cellen een aantal karakteristieken van een functionele BCSFB de vorming van TJstrengen, de ontwikkeling van een hoge transepitheliale membraanpotentiaal welke bepaald als transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en geringe permeabiliteit voor macromoleculen. Bovendien HIBCPP cellen brengen karakteristieke transporters, die kunnen dienen tot de ionische micro-omgeving te reguleren, en tonen apicale / basolaterale polariteit 5,6,7.
De BCSFB is aangetoond gefunctioneerd als ingangsplaats voor ziekteverwekkers (bacteriën, virussen en schimmels) in het centrale zenuwstelsel (CNS) 8. De invasie van ziekteverwekkers, waaronder Neisseria meningitidis (N. meningitidis), een Gram-negatieve bacterie kan ernstige ziekten zoals meningitis veroorzaken. Bewijs dat het overwint de beschermende epitheliale barrière van de CP wordt ondersteund door histopathologische observaties bij patiënten met meningokokken ziekte vertonen verhoogde hoeveelheden van meningokokken in de vaten en CP epitheelcellen 9,10. Om binnenkomst in gastheercellen ba te krijgencteria kapen vaak endocytotische mechanismen, die worden gemedieerd of veroorzaakt door specifieke oppervlakte receptoren op de gastheercellen. Aangezien interacties van pathogenen met deze receptoren kunnen soortspecifiek 11, diermodellen kunnen alleen worden geraadpleegd beperkte mate. De HIBCPP cellijn biedt de mogelijkheid om de invasie proces en de onderliggende moleculaire mechanismen in een humaan model te bestuderen. Gebruikmakend van celkweek inserts stelt ons in staat om interacties van pathogenen analyseren gastheercellen uit twee verschillende cel kanten. Veel bacteriën, inclusief N. meningitidis, sterk de invloed van de zwaartekracht tijdens infectie tests onderworpen. Optimale interactie van pathogenen met HIBCPP cellen tijdens de testen worden de bacteriën eerst toegevoegd aan het bovenste compartiment van de celkweek filterinzetstuk systeem. Om infectie inschakelen van het apicale of basolaterale celkant respectievelijk twee varianten van het in vitro systeem zijn established: In het standaardsysteem HIBCPP cellen worden gezaaid in het bovenste compartiment van het filterelement, het nabootsen van de situatie wanneer micro-organismen op het CB-kant en in contact met de apicale zijde van de cellen (Figuur 1 A, C). In tegenstelling tot het gebruik van de HIBCPP cellen in een omgekeerde celcultuur filter insert systeem weerspiegelt de voorwaarden wanneer bacteriën de bloedbaan hebt ingevoerd. Micro-organismen verspreiden in het bloed en ontmoeting CP epitheelcellen van de basolaterale zijde (Figuur 1B, D). Opmerkelijk in dit modelsysteem is aangetoond dat bacteriën tasten HIBCPP cellen in een polair wijze bepaald uit de basolaterale zijde cel 5,7.
Vervolgens infectie van de CP, kan de invasie ziekteverwekkers worden herkend door het aangeboren immuunsysteem door middel van ligatie aan receptoren patroonherkenning (PRRS). Goed beschreven leden van het PRRS behoren tot de Toll-achtige receptor (TLR) familie. kan TLRs bind karakteristieke structuren van besmettelijke micro-organismen, die genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zijn. Ligatie van de receptoren leidt tot activatie gastheercel signaaltransductiecascades dat expressie van cytokines en chemokines 12, die op zijn beurt stimuleert transmigratie van immuuncellen in de BCSFB 13,14 activeren. Het is aangetoond dat HIBCPP cellen brengen verschillende TLRs op mRNA-niveau en dat infectie met N. meningitidis resulteert in afscheiding van verschillende cytokinen en chemokinen, waaronder CXCL1-3, IL6, IL8 en TNFa 15,16.
We beschrijven kweek en infectie van de humane cellijn HIBCPP in omgekeerde celkweek insert systeem dat BCSFB nabootst. Dit modelsysteem toelaat om interacties van pathogenen met de in vivo desbetreffende basolaterale celkant en de daaropvolgende cellulaire respons studie.
De epitheelcellen van de CP vormen de BCSFB dat de CSF uit het bloed 2,3 scheidt. We hebben onlangs vestigde de HIBCPP cellijn als een functioneel humaan model van de BCSFB. De cellen vertonen belangrijke barrièrefunctie van de BCSFB in vitro, waaronder de ontwikkeling van een hoge membraanpotentiaal, een lage permeabiliteit voor macromoleculen, alsmede de aanwezigheid van continue strengen TJs 5. TJ eiwitten dragen bij aan een apicale / basolaterale polariteit van de cellen. De polaritei…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
Insulin | Sigma | 19278 | |
MgCl2 | Sigma | 2393 | |
NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
Proteose peptone | BD | 211684 | |
Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |