Infarto del miocardio in topi neonati, un modello di rigenerazione cardiaca

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

L'infarto miocardico indotta da legatura coronarica è stato utilizzato in molti modelli animali come strumento per studiare i meccanismi di riparazione e rigenerazione cardiaca, e di definire nuovi bersagli per terapie. Per decenni, i modelli di rigenerazione cardiaco completo esistevano in anfibi e pesci, ma una controparte di mammifero non era disponibile. La recente scoperta di una finestra postnatale durante la quale i topi possiedono capacità rigenerative ha portato alla creazione di un modello di mammiferi di rigenerazione cardiaca. Un modello chirurgica di rigenerazione cardiaca mammiferi nel topo neonatale è presentato qui. In breve, postnatale giorno 1 (P1) i topi sono anestetizzati con isoflurano e collocato su un tampone di ghiaccio per indurre ipotermia. Dopo il torace è aperto, e discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) è visualizzata, una sutura è disposta intorno alla LAD infliggere ischemia miocardica nel ventricolo sinistro. La procedura chirurgica richiede 10-15 minuti. Visualizzare l'arteria coronaria ècruciale per sutura accurate e riproducibilità. Infarto del miocardio e disfunzione cardiaca sono confermati da cloruro di trifenil-tetrazolio (TTC) di colorazione e l'ecocardiografia, rispettivamente. completa rigenerazione 21 giorni dopo l'infarto miocardico è verificato da istologico. Questo protocollo può essere utilizzato come strumento per chiarire i meccanismi di rigenerazione cardiaca mammiferi dopo infarto miocardico.

Introduction

Infarto del miocardio (MI) è una delle principali cause di morte nel mondo, e rimane responsabile di circa un terzo dei casi di insufficienza cardiaca ^1. Mentre l'avvento di intervento percutaneo e continua ottimizzazione dell'uso di trombolitici è aumentato riperfusione seguente MI, cardiomiociti morte e la perdita di contractile miocardio si verifica comunque. Restano anche un gran numero di pazienti "no-opzione" che non sono candidati o non vedono beneficiare di questi interventi. Questi pazienti continuano a subire ischemia invalidanti che portano alla formazione di cicatrice e rimodellamento ventricolare deleteria come un meccanismo di infarto guarigione. Questo processo in ultima analisi, insufficienza cardiaca, per cui la prognosi rimane scarsa, nonostante la gestione farmacologica ottimale con enzimi inibitori (ACE) dell'enzima di conversione dell'angiotensina e beta-bloccanti. Purtroppo, il tasso di mortalità a un anno per i pazienti con funzione ventricolare sinistra gravemente compromessa ancora rimane comealto come il 26% ^2. trapianto di cuore è l'opzione di trattamento finale per i pazienti con insufficienza cardiaca. Tuttavia, il pool di donatori limitato per il trapianto di cuore non fanno di questo una valida opzione per maggior parte dei pazienti. Così, la scoperta di nuovi agenti terapeutici per ripristinare il miocardio danneggiato resta fondamentale per risolvere il problema della malattia cardiaca. modelli animali affidabili di danno cardiaco sono quindi richiesti una componente fondamentale di questo processo.

Dogma tradizionale ha dettato che cardiomiociti adulti sono post-mitotico, terminally cellule differenziate, in grado di dividere o de-differenziazione per sostituire il miocardio danneggiato ^3. In quanto tale, un cuore dei mammiferi adulti non avrebbe mai potuto recuperare completamente da un infortunio, e cardiomiociti perso sarebbe stato sostituito con tessuto fibroso. Così, la ricerca si è concentrata principalmente sugli agenti terapeutici per ridurre al minimo l'espansione dell'infarto e ridurre la formazione di cicatrici. Più di recente, tuttavia, si è verificato un cambiamento di paradigmanel pensiero circostante guarigione cardiaco e molti sforzi di ricerca sono stati reindirizzati a concentrarsi sul potenziale di rigenerazione cardiaca ^4.

Fino a poco tempo, lo studio in vivo della rigenerazione cardiaca è stato limitato ai modelli non vertebrati, come quelli anfibi Urodeli e pesci teleostei ^5-7. Tuttavia, la scoperta della capacità di rigenerazione cardiaca nel topo neonatale ha portato allo sviluppo di due modelli chirurgici di rigenerazione cardiaca mammiferi: resezione del cardiaca occlusione dell'arteria coronaria vertice e di indurre infarto miocardico ^8,9. Nel 2011, un modello di resezione dell'apice del mouse è stato utilizzato per dimostrare che la rigenerazione cardiaca completa disponibile in giorno postnatale 1 (P1). Tuttavia, questa capacità diminuisce rapidamente dopo il periodo neonatale iniziale. Il cuore dei mammiferi perde il suo potenziale rigenerativo poco dopo la nascita a P7 come il numero di cellule progenitrici declino, e cardiomiociti diventare binucleate, perderela loro competenza proliferativa, e in modo permanente uscire al ^10,11 ciclo cellulare. Capire le differenze fondamentali tra il neonatale e adulta cuore dei mammiferi può portare a nuovi approfondimenti di rigenerazione cardiaca.

Mentre la resezione dell'apice offre infatti spaccato ricrescita del tessuto contrattile, il modello non simula danno cardiaco umano tipico, e pertanto non si presta anche per lo sviluppo di terapie. Il modello di arteria occlusione coronarica, tuttavia, simula più direttamente gli aspetti fisiopatologici della MI patologia, e quindi può fornire spunti più utili in meccanismi che possono essere applicabili al progresso terapeutico per uso umano.

Legatura coronarica chirurgica è stato usato come un utile tecnica sperimentale in molti modelli animali ^12-14. In coronaria modello di legatura adulti, gli animali sono anestetizzati e intubati per consentire l'apertura della cavità toracica mantenendo respiratisopra. Il cuore continua a battere regolarmente, permettendo la visualizzazione del sistema vascolare coronarica e consentendo il posizionamento della sutura accurata. Inoltre, il cuore rimane rosa come perfusione continua, e dopo la legatura miocardio ischemico appare pallido, indicando successo legatura dell'arteria coronaria. Il protocollo descritto per topi neonati, tuttavia, è meno affidabile come l'arteria coronaria non viene visualizzato e il chirurgo deve valutare dove posizionare la sutura ^15. Sebbene l'anatomia generale del sistema vascolare coronarico è la stessa, la variabilità singolo animale nella direzione e ramificazione della LAD esiste ^16. Così, quando "andare in cieco", l'arteria potrebbe essere facilmente perso. Altre tecniche, come l'ecocardiografia sono poi tenuti a confermare l'induzione di successo di MI, e per assicurare tutti gli interventi chirurgici comportano una dimensione dell'infarto simile. Qui descritto è un miglioramento su un metodo di recente pubblicato ^{il 15,} in cui la posizione del LAD può essere allacpubbli- e quindi LAD può essere legata per indurre riproducibile MI.

Questa tecnica non richiede intubazione endotracheale o la ventilazione meccanica, come toracotomia in uno stato ipotermico nel topo neonatale non provocare il collasso del polmone. Tuttavia, nel metodo precedentemente descritto, ipotermia grave deve essere indotto a punto sia apnea completa e cessazione del ritmo cardiaco ^15. Il principale limite di questo approccio è che l'arteria coronaria non è perfuso e cuore appare chiaro anche prima LAD legatura. Nell'approccio qui descritto, visualizzazione coronarica è possibile in una fase di torpore prima profonda ipotermia e cardiaco cessazione ritmo, con recupero completo del mouse neonatale dopo l'intervento chirurgico. Questo metodo offre il grande vantaggio di 100% riproducibilità.

Protocol

coppie nidificanti di topi CD-1 IG-S C57BL / 6 e sono stati acquistati da Charles River. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in conformità con le linee guida del Consiglio canadese sulla cura degli animali, e protocolli di studio sono stati approvati dal Animal Usa sottocommissione alla Western University, London, Canada. 1. Animal Care Dopo il parto è completa e cuccioli sono stati inizialmente allattati al seno dalla madre per pochi ore, metterli in una…

Representative Results

La procedura di infarto miocardico a P1 può essere completato in 10 – 15 minuti e ha un tasso di mortalità del 7,8% (5 su 64 cuccioli). Dopo l'intervento chirurgico, i topi recuperare da anestesia ipotermico entro i prossimi 5 – 20 min (tempo di recupero dipende dalla temperatura del corpo raggiunta durante l'anestesia e la velocità del chirurgo). Quando si utilizza cuccioli P7 (per confronto con un miocardio non rigenerativo), è necessario un periodo di raffreddamento più t…

Discussion

La legatura LAD chirurgica dimostrato qui è un metodo affidabile per produrre MI in topi neonati. Questo modello fornisce ai ricercatori con un modello riproducibile con cui studiare la rigenerazione del cuore dei mammiferi. La visualizzazione del sistema vascolare coronarico è un componente chiave di questo metodo, garantendo il posizionamento della sutura corretta e garantendo così la riproducibilità. Mentre topi adulti non possiedono le capacità poikilothermic, la temperatura corporea e il metabolismo dei topi n…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice