Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP Res. Ces maladies touchent une grande variété d'espèces , y compris l' encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l' homme 1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronale, et les dépôts de plaque. Finalement, ce qui entraîne la mort de l'animal / personne 4. Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les composés destinés à ralentir ou arrêter la progression de la maladie du prion. Cependant, les chercheurs ont pas trouvé soit une thérapie réussie ou un véhicule de livraison systémique efficace.
L' expression endogène de PrP C est nécessaire pour le développement des maladies à prion 5 </sup>. Par conséquent, en diminuant ou en éliminant l' expression PrP C peut entraîner un retard ou l' amélioration de la maladie. Plusieurs groupes ont créé des souris transgéniques avec des niveaux réduits de PrP C ou lentivecteurs injectés exprimant shRNA directement dans le tissu cérébral murin pour étudier le rôle des niveaux d'expression de la PrP C dans les maladies à prions. Ces chercheurs ont constaté la réduction de la quantité de neurones PrP C ont donné lieu à l' arrêt de la neuropathologie progressive des maladies à prions et prolongé la durée de vie des animaux 6-9. Nous avons signalé que les résultats de traitement PrP C siRNA de la clairance de la PrP Res dans les cellules de neuroblastome de souris 10. Ces études suggèrent que l'utilisation des thérapies pour réduire les niveaux d'expression de la PrP C, comme des petits ARN interférents (siRNA), qui clive l' ARNm, peut suffisamment retarder la progression des maladies à prions. Cependant, la plupart des thérapies étudiées pour les maladies à prions ont été livrées d'une manière qui ne serait pas pratiquedans un contexte clinique. Par conséquent, une thérapie par ARNsi a besoin d'un système d'administration systémique, qui est délivré par voie intraveineuse et ciblée vers le système nerveux central.
Chercheurs ont étudié l'utilisation de liposomes en tant que véhicules de délivrance pour des produits de thérapie génique. Des lipides cationiques et anioniques sont utilisés à la fois dans la formation des liposomes. Des lipides cationiques sont plus largement utilisés que les lipides anioniques, car la différence de charge entre le lipide cationique et l'ADN / ARN permet un conditionnement efficace. Un autre avantage de lipides cationiques est celle qu'ils traversent la membrane cellulaire plus facilement que d' autres lipides 11-14. Cependant, les lipides cationiques sont plus immunogènes que les lipides anioniques 13,14. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à passer de l'aide cationique anioniques lipides dans des liposomes. Les produits de thérapie génique peuvent être efficacement emballés dans des liposomes anioniques , en utilisant le sulfate de protamine peptide chargé positivement, qui condense les molécules d' ADN / ARN 15-19. Depuis lipi anioniqueds sont moins immunogènes que les lipides cationiques , ils peuvent avoir une augmentation des temps de circulation, et peuvent être plus tolérés dans des modèles animaux 13,14. Les liposomes sont ciblés vers des tissus spécifiques en utilisant des peptides de ciblage qui sont attachés à des liposomes. Neuropeptide RVG-9R, qui se lie à des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine, a été utilisé pour cibler l' ARNsi et des liposomes au système nerveux central 17-20.
Ce rapport décrit un protocole pour produire trois véhicules de livraison de siRNA et d'emballer et de livrer le siRNA aux cellules neuronales (Figure 1). les complexes liposome-siRNA peptide (LSPCs) sont composées de liposomes avec l'ARNsi et RVG-9R peptide ciblant électrostatiquement fixés sur la surface extérieure du liposome. Peptide thérapeutique encapsulé dans des liposomes adressé siRNA (PALETS) sont composés d'ARNsi et la protamine encapsulé dans le liposome, avec RVG-9R lié de manière covalente à des groupes de lipides PEG. En utilisant les méthodes ci-dessous pour générer LSPCs et PALETS, PrP C siRNA diminue PrP C expression jusqu'à 90% dans les cellules neuronales, qui détient la promesse énorme pour guérir ou retarder l'apparition de la pathologie de la maladie du prion sensiblement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d'administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l'injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l'injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d'expre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
References
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