Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Summary

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Abstract

Nucleosomen zijn de kleinste structuureenheid chromatine, bestaande uit 147 basenparen van DNA rond een octameer van histon eiwitten. Histon functie wordt gemedieerd door uitgebreide post-translationele modificatie door een groot aantal kerneiwitten. Deze wijzigingen zijn van cruciaal belang voor de nucleaire integriteit als ze regelen chromatine structuur en werven enzymen betrokken bij genregulatie, DNA-reparatie en chromosoom condensatie. Hoewel een groot deel van de wetenschappelijke gemeenschap antilichaam gebaseerde technieken neemt karakteriseren histon PTM overvloed, deze benaderingen zijn lage doorvoer en voorgespannen tegen hypermodified proteïnen, zoals het epitoop kan worden belemmerd door nabijgelegen modificaties. Dit protocol beschrijft het gebruik van nano vloeistofchromatografie (nLC) en massaspectrometrie (MS) voor kwantificatie van histon modificaties. Deze methode is bedoeld om een ​​grote verscheidenheid aan histon PTMs en de relatieve abundantie van verschillende histon karakteriseren varianten binnen single analyses. In dit protocol wordt histonen gederivatiseerd met propionzuuranhydride, gevolgd door digestie met trypsine om peptiden te genereren 5 – 20 aa lang. Na digestie, de nieuw blootgestelde N-termini van de peptiden histon gederivatiseerde chromatografische retentie te verbeteren tijdens nLC-MS. Deze methode maakt het mogelijk voor de relatieve kwantificatie van histon PTMs verspreid over vier ordes van grootte.

Introduction

Epigenetische wordt gedefinieerd als de studie van erfelijke veranderingen in genexpressie die ontstaan ​​door andere dan veranderen van de onderliggende DNA-sequentie ¹ mechanismen. Epigenetische regulatie is cruciaal tijdens ontwikkeling als het organisme ondergaat dramatische fenotypische veranderingen hoewel het DNA inhoud niet verandert. Er zijn verschillende kritische componenten worden aangezogen voor epigenetische onderhoud, waaronder histon post-translationele modificaties (PTM), histon varianten, niet-coderende RNA, DNA methylatie en DNA-bindende factoren, die elk genexpressie beïnvloeden via verschillende mechanismen ^2. Bijvoorbeeld, terwijl DNA methylatie is een zeer stabiele modificatie dat gentranslatieproduct ^3, histon varianten en histon PTMs veel dynamischer en kunnen beïnvloeden chromatine op verschillende manieren ⁴ onderdrukt.

Histon PTMs meestal gelokaliseerd op het N-terminale staarten, aangezien zij de blootgestelde en flexibele gebiedvan het eiwit. Echter, de nucleosoomkern ook sterk veranderd vergeleken met gemiddeld ⁵ eiwitten. Hoewel histon merken zijn uitgebreid gekarakteriseerd in de afgelopen tien jaar, veel links tussen bekende histon merken en hun functie zijn nog onduidelijk. Dit is grotendeels te wijten aan het feit dat de meeste histon PTMs werken niet alleen, maar werken in combinatie met andere PTM ( "overspraak") als een specifieke behandeling zoals transcriptie ^6,7 veranderen. Bijvoorbeeld, de combinatorische H3S10K14ac markering op het gen p21 activeert de transcriptie, die zou optreden bij slechts één van de twee PTMs ^8. Het eiwit HP1 compacts chromatine door de erkenning van H3K9me2 / me3 en het verspreiden van de wijziging naar het nabijgelegen nucleosomen. Toch kan HP1 niet binden H3K9me2 / 3 als de aangrenzende S10 is gefosforyleerd ^9. Acetylering van H3K4 remt binding van het eiwit aan spChp1 H3K9me2 / me3 in Schizosaccharomyces pombe ^10. Bovendien is de histon lysine demethylase PHF8 heeft het hoogste nucleosoom binden efficiency toen drie PTMs H3K4me3, K9ac en K14ac aanwezig ¹¹ zijn. Deze voorbeelden benadrukken het belang van het bereiken van een globaal overzicht van histon PTM veranderingen in plaats van zich te concentreren op enkele wijzigingen.

De aanwezigheid van sequentievarianten verhoogt ook de complexiteit van histon analyse, zoals histon isotypes zeer vergelijkbare sequenties in het algemeen, maar hebben vaak meerdere rollen in chromatine. Bijvoorbeeld H2A.x een C-terminale sequentie die gemakkelijker wordt gefosforyleerd na DNA schade in vergelijking met canonieke H2A ^12, en is vereist voor inactivering geslachtschromosomen bij mannelijke muizen meiosis ^13; evenzo CENP-A vervangt canonieke histon H3 in centromeren ^14. Ondanks de verschillende functies, deze varianten hebben een groot deel van hun aminozuursequentie met de respectieve canonieke histon, waardoor het moeilijk te identificeren en te kwantificeren afzonderlijk. </p>

Antilichamen gebaseerde technieken zoals Western blotting zijn uitgebreid aangenomen histonen karakteriseren. Echter, antilichamen gebaseerde benaderingen zijn beperkt om de volgende redenen: (i) zij kunnen alleen bevestigen de aanwezigheid van een modificatie en kan niet onbekende fosforylatie identificeren; (Ii) zij zijn voorgespannen door de aanwezigheid van gelijktijdig bestaande merken, die bindingsaffiniteit kunnen beïnvloeden; (iii) zij kunnen niet combinatoriële tekens identificeren, omdat slechts zeer weinig antilichamen beschikbaar voor dit doel en (iv) ze kruisreageren tussen zeer vergelijkbare histone varianten of soortgelijke PTM (bijvoorbeeld di- en trimethylering van lysineresten). Egelhofer et al. beschreven die meer dan 25% van de handel verkrijgbare antilichamen niet specificiteitonderzoeken door dot blot of western blot, en bij specifieke antilichamen niet meer dan 20% in chromatine immunoprecipitatie experimenten ^15. Massaspectrometrie (MS) is op dit moment het meest geschikt analytisch instrument om nieuwe en / of combinatorische PTMs te studeren,en het is uitvoerig toegepast voor histon eiwitten (besproken in ^16). Dit komt vooral door een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid van massa van MS, en de mogelijkheid uit te voeren grootschalige analyses.

De bottom-up strategie is de meest gebruikte MS-based proteomics strategie voor histon karakterisatie en PTM's, waarbij het intacte eiwit enzymatisch gedigereerd tot korte peptiden (5-20 aa). Deze digestie maakt zowel LC scheiding en MS detectie. Massa in het bereik van 600 – 2000 Da worden vaak gemakkelijker geïoniseerd en geïdentificeerd met grotere massa nauwkeurigheid en resolutie dan grotere massa. MS / MS fragmentatie wordt ook verbeterd als korte peptiden zijn algemeen goed geschikt voor botsing geïnduceerde dissociatie (CID). Echter, histonen vormen een uitdaging voor ondersteboven MS zij sterk zijn verrijkt in basische aminozuurresiduen, namelijk lysine en arginine. Daarom trypsine digestie leidt tot de vorming van peptiden die te smallemaal voor LC retentie en eenduidige lokalisatie van het PTMs. Om dit probleem te omzeilen, ons protocol omvat lysine en peptide N-terminale chemische derivatisering ^17. Het gebruik van propionzuuranhydride wordt aanbevolen voor sterke chemische derivatisering in vergelijking met andere reagentia ^18. Dergelijke derivatisering blokkeert de ɛ-aminogroepen van ongemodificeerde en monomethyl lysineresten, zodat trypsine tegen proteolyse voeren Pas bij het C-terminale arginine residuen. Gederivatiseerde aminen kunnen niet protonen uitwisselen met de oplossing en aldus de peptiden worden veelal pas dubbel of drievoudig geladen vergemakkelijken MS en MS / MS detectie. Bovendien N-terminale peptide derivatisering verhoogt hydrofobiciteit en derhalve omgekeerde fase chromatografische. Hier beschrijven we de workflow te histonen zuiveren en hen voor te bereiden PTM analyses via bottom-up proteomics (figuur 1). Deze strategie realiseert kwantificering van enkele histon merken en combinatorische merken fof histon fosforylatie die relatief dicht in de aminozuursequentie.

Protocol

1. Verzameling van cellen van Culture Als cellen in suspensie werden geteeld, de cellen door centrifugeren bij 300 RCF gedurende 5 min. Als hechtende, aspireren en gooi cel medium. Spoel de aangehechte cellen met PBS zonder Ca2 + en Mg2 + (aangeduid als PBS toekomst). Incubeer de cellen in ofwel trypsine of trypsine-EDTA (0,025% – 0,5%, afhankelijk van de cellijn) met voldoende volume om het oppervlak van de platen te bedekken bij 37 ° C tot cellen los (varieert voor verschillende cellijnen). Verzamel cellen door centrifugeren bij 300 RCF gedurende 5 min. Was de cellen twee keer in PBS en verzamelen door centrifugeren. Schat de hematocriet ongeveer vanaf de afstudeerders die op de 1,8 ml buizen of 15 ml conische buizen. Noot: Cellen uit de kweek kan worden snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C beperking in dit stadium. 2. Isolatie van Kernen uit intacte cellen </p> Dooi cellen op ijs. Dooi nucleaire isolatie buffer (NIB, tabel 1). Bereid ongeveer 5 ml NIB buffer (tabel 1) voor elke 100 ul hematocriet. Voor elke 1 ml NIB buffer, voeg proteaseremmers en stabilisatoren als volgt: 1 ui 1 M DTT, 2,5 gl 200 mM AEBSF, 2 pl 2,5 uM microcystine en 2 pl 5 M natrium butyraat. NIB met remmers zullen worden aangeduid als NIB vanaf dit punt naar voren. Opmerking: als histon fosforylering wordt bestudeerd, onder meer EDTA gratis protease en fosfatase-inhibitor cocktail. Verwijderen van een vijfde deel van NIB buffer aldus bereide toevoegen NP-40 Alternatief (tabel 1) tot een eindconcentratie van 0,2%. De resterende vier-vijfde volume wordt gebruikt voor wassen. Wassen celpellet in 01:10 celpellet NIB zonder NP-40 Alternatieve verhouding (v / v). Verwijder supernatant door centrifugatie bij 700 RCF gedurende 5 min. Lyse de cell pellet door het op ijs en toevoegen van 01:10 celpellet NIB met 0,2% NP-40 Alternatieve (v / v). Als extraheren uit weefselmonsters, homogeniseren met behulp van vijzel of dounce homogenisatoren. Gekweekte cellen kunnen worden gehomogeniseerd door voorzichtig pipetteren. Incubeer gehomogeniseerde cellen op ijs gedurende 5-10 min. De cellen lyseren en de kernen los. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 5-10 minuten bij 4 ° C. De pellet bevat meestal celkernen, terwijl de supernatant bevat voornamelijk cytoplasmatische componenten. Sla het cytoplasma-fractie indien gewenst. Was de kernen pellet door voorzichtig resuspenderen in 01:10 (v / v) NIB zonder NP-40 Alternative. Opmerking: Deze wasstap uitsluitend om sporen van wasmiddelen voorafgaand aan het extraheren van histonen uit kernen te verwijderen. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder supernatant. Herhaal stap 2,10-2,11 tenminste tweemaal volledig verwijderen NP-40 Alternative. Verwijdering van NP-40 Alternatief is duidelijk eens zachte pipetteren tijdens het wassen stap niet meer vormt bubbels. Voor histon extractie uit weefsels: Spoel verse of ontdooide ingevroren weefsel in ijskoude NIB. Transfer weefsel een petrischaal op ijs met NIB, net genoeg om het weefsel nat te houden. Dice in de kleinste stukjes (<1 mm) met een scheermesje aan de oppervlakte contact voor kernen isolatie te verhogen. transfer gehakt weefsel naar vooraf gekoelde homogenisator en wassen nib door neer pipetteren. verwijderen buffer centrifugeren bij 300 rcf gedurende 5 min. voeg np-40 alternatief cellen in cellen: buffer-verhouding van 01:10 (v > 95% van de voltooiing van de reactie. Vul propionzuuranhydride fles met argon gas om de vorming van azijnzuur met de lucht in de fles te voorkomen. Opmerking: Interim stopplaats: Monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C opgelost in DDH 2 O of gedroogd. 7. Proteolytische Digestie met trypsine Resuspendeer histonen in 50 mM NH 4 HCO 3 een optimale concentratie van 1 ug / ul of hoger bereiken. Meer verdunde monsters leiden tot trypsine-efficiëntie te verlagen. Opmerking: de histonen bij deze stap moet zijn bij een pH van 8,0 Als het dan nog zuur, dan NH 4 HCO 3 zout te proeven met behulp van pipet tip toe te voegen. trypsine Naar histon monsters in een 01:10 verhouding (gew / gew). Incubate bij 37 ° C gedurende 6-8 uur. Stop de spijsvertering door het bevriezen in -80 ° C. Droog het monster af tot 10-20 pl onder vacuüm concentrator. Opmerking: Interim stopplaats: Monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C. 8. Propionylation van Histon peptiden bij N-uiteinden Opmerking: Dit deel beschrijft de derivatisering van het peptide N-uiteinden gegenereerd uit de trypsine digest. Dergelijke procedure verbetert HPLC retentietijd van de kortste peptiden (bijvoorbeeld, aminozuren 3-8 van histon H3), de propionylgroep verhoogt peptide hydrofobiciteit. Resuspendeer monsters in 30 ui 100 mM NH 4 HCO 3. Herhaal stap 6,1-6,9. Opmerking: Het is normaal dat het drogen van de monsters in vacuüm duurt langer bij deze stap. Resuspendeer of verdunde monsters met 50 – 100 pl DDH 2 O + ofwel 0,1% TFA of 0,5% azijnzuur. Opmerking: Azijnzuur wordt aanbevolen voor lange opslag, zoals TFA facilitates methionine oxidatie op de lange termijn. Aan de andere kant, wordt TFA aanbevolen als stage-tipping (hoofdstuk 9) op dezelfde dag wordt uitgevoerd, als TFA helpt een betere chromatografische. Opmerking: Interim stopplaats: Monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C. 9. Sample Ontzouten met Stage-tips Opmerking: In dit stadium is het zout aanwezig in het monster. Zouten belemmeren HPLC-MS analyse omdat ze ioniseren tijdens elektrospray, onderdrukken van het signaal van peptiden. Zouten kunnen ook gevormd ionische adducten op peptiden, waardoor de signaalintensiteit voor de niet-adduct peptide. Aangezien de geadduceerd peptide een verschillende massa hebben, het peptide zal niet correct geïdentificeerd of gekwantificeerd. Door een P1000 pipetpunt, slaat een schijf van C 18 materiaal uit een vaste fase extractie schijf. Duw de minidisk uit de P1000 tip met behulp van een fused silica capillair en de minidisk storten op de bodem van een P100 / 200 pipet tip. Zorg ervoor dat de disk stevig ingeklemd onder aan het uiteinde (figuur 3). Opmerking: de P1000 tip heeft een vrij klein gaatje naar de C 18 schijf punch. Het is wenselijk om de laatste centimeter van de punt te snijden om een ​​gat te hebben met een grotere diameter. Gebruik twee C 18 stoten in dezelfde P100 / P200 tip als ontzouten meer dan 25 ug monster. Gebruik een centrifuge adapter om stage-tips zijn plaats te houden in 1,5 ml of 2 ml microcentrifugebuizen. Gebruik slow (300 – 400 RCF) rotatie; de oplosmiddelen passeren gewoonlijk de hars binnen een minuut. Spoel de hars door het draaien met 50 ul 100% acetonitril de C 18 materiaal activeren en verwijdering van potentiële verontreinigingen. Evenwicht schijf door spoelen 80 ul van 0,1% TFA door langzame centrifugeren. Aanzuren van het monster tot pH 4,0 of lager met azijnzuur. Controleer de pH met een pH-strips monster verlies te minimaliseren. Load sample op de schijf door langzame centrifugeren. Wassenmonster door spoelen 70 – 80 gl 0,1% TFA door langzame centrifugatie. Elueer monster door te spoelen 70 ul 75% acetonitril en 0,5% azijnzuur door langzame centrifugeren. Verzamel het monster in een 1,5 ml buis. Droge monster in een vacuüm concentrator. Opmerking: Interim stopplaats: Monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C. 10. Analyse van peptiden Histone Opmerking: De nLC-MS platform moet worden opgezet zoals gedaan in de traditionele peptide analyse. Het gebruik van 200-300 nl stroom kolom (75 urn ID analytische kolom C 18 deeltjes) wordt aanbevolen, aangezien zij een uitstekend compromis tussen gevoeligheid en stabiliteit. De MS overname methode kan ofwel een combinatie van data-afhankelijke acquisitie (DDA) met gerichte scans 19 of een data-acquisitie onafhankelijke (DIA) 20,21, zowel in Representatieve resultaten en Figuur 4 is beschreven. Bereid HPLC buffers – A: 0,1% mierenzuur inHPLC-grade water; B: 0,1% mierenzuur in acetonitril van HPLC-kwaliteit. Programmeer de HPLC-methode als volgt: van 0 tot 30% buffer B in 30 min, 30-100% B gedurende de volgende 5 minuten en isocratisch 100% B gedurende 8 min. Indien niet HPLC geautomatiseerde kolomequilibratiebuffer voordat monsterbelading wordt geprogrammeerd, dan zijn de volgende: gradiënt 100-0% B in 1 min en isocratisch stroom bij 0% B gedurende 10 min. Stel het debiet van de analyse 250-300 nl / min. Programmeer de MS overname methode uit te voeren, hetzij DDA in combinatie met gerichte scans 19 of DIA 20,21 (figuur 4). Zorg ervoor dat de MS duty cycle laat een volledige MS te scannen elke ~ 2 sec, om genoeg gegevens punten moeten over de chromatografische piek, die meer accurate kwantificering mogelijk maakt. Opmerking: met C 18 chromatografie, de gemiddelde piekbreedte ongeveer 30 seconden voor de hierboven beschreven verloop. Plaats ongeveer 1 pg van het monster op de HPLC-column. Voer het HPLC-MS / MS methode zoals geprogrammeerd. Opmerking: In het protocol hebben we geen details van de kolommen, MS instrumenten of MS parameter gegevens adviseren, zoals elke optimale setup dat een individu proteomics lab ontwikkeld die geschikt zijn voor de methode zal zijn. Proteomics laboratoria moeten hun optimale opstelling te kunnen gebruiken, aangezien histon peptiden te scheiden als de traditionele peptiden. 11. Data Analysis Importeer de MS RAW-bestanden in de software om piekoppervlakte integratie uit te voeren. Opmerking: EpiProfile 22 wordt aanbevolen, want het is geoptimaliseerd voor histon peptiden; met behulp van de retentietijd kennis van elutie hij presteert betrouwbaar piekoppervlak winning van bekende histon peptiden. Als alternatief, Skyline 23 is een ideale software voor het doel. Bereken de relatieve abundantie van een bepaald peptide door het te delen door het totale oppervlak van dat peptide in elk van de gemodificeerde vormen ervan. Opmerking: In het geval van ontdekking analysis Mascot wordt aanbevolen om spectra van gemodificeerde histon peptiden te identificeren. De prestaties van deze tool is onlangs 24 beschreven. Alle andere database-zoekmachines voor proteomics zijn ook bruikbaar, maar bij onze tests op voorwaarde dat ze lagere prestaties.

Representative Results

Als voorbeeld analyseerden wij histonen geëxtraheerd uit humane embryonale stamcellen (hESC 's) met en zonder retinoïnezuur (RA) stimulatie, beginnend met 200 pi celpellets. Aanwezigheid van RA in celkweek leidt tot ESC differentiatie. Uit de cel pellet, ongeveer 50 – 100 ug histonen werden geëxtraheerd, wat meer dan voldoende is om meerdere LC-MS injecties van histon peptiden voeren. Na derivatisering digestie en ontzouting, werden de monsters op een 75 urn x 15 cm C18 kolom (deeltjesdiameter 3 urn, poriegrootte 300 A) in seriële mode met een high-performance liquid nano chromatografiesysteem met microfluïdische chips gekoppeld aan geladen een hybride lineaire trap quadrupole – orbitrap massaspectrometer. MS acquisitie werd uitgevoerd met behulp van DIA. Daarnaast werden monsters ook geanalyseerd met een DDA werkwijze met een nano-stroom UHPLC gekoppeld met een hybride-ion trap massaspectrometer orbitrap (gegevens niet getoond). Inelke cyclus, een volledige MS orbitrap detectie werd uitgevoerd met het scanbereik van 290 tot 1400 m / z, een resolutie van 60.000 (bij 200 m / z) en de AGC van 10 6. Vervolgens data afhankelijke acquisitiemodus werd met een dynamische uitsluiting van 30 sec. MS / MS scans werden gevolgd op de ouder-ionen van de meest intense degenen. Ionen met een laadtoestand van één werden uitgesloten van MS / MS. Een isolatie raam van 2 m / z werd gebruikt. Ionen werden gefragmenteerd met behulp van botsing geïnduceerde dissociatie (CID) met collision energie van 35%. Ion val detectie werd gebruikt met de normale scan range-modus en een normale scansnelheid met AGC van 10 4. Ruwe MS-gegevens werden geanalyseerd vaststelling software voor de winning van precursor en fragment ion chromatogrammen, namelijk Skyline 23 en 22 EpiProfile. EpiProfile is geoptimaliseerd voor histon peptiden, omdat daarin intelligente piekoppervlak extractie door voorkennis peptij retentietijd. Anderzijds wordt Horizon geoptimaliseerd voor DIA analyses, en dus de DIA figuren weergegeven (Figuren 4 en 5A) zijn afbeeldingen van deze software. Van de geëxtraheerde ionenchromatogram, wordt het oppervlak onder de curve opgehaald, en dit wordt gebruikt om de overvloed van elk peptide te schatten. Het gebied van de chromatografische piek werd berekend voor [M + H] +, [M + 2H] 2+ en [M + 3H] 3+ ionen van hetzelfde peptide, hoewel in de meeste gevallen de [M + 2H] 2+ was de voorkomende vorm. Dit verschaft het ruwe overvloed van een bepaalde gemodificeerde vorm van een peptide. Om de relatieve abundantie van PTMs bereiken, de som van alle verschillende gemodificeerde vormen van een histon peptide werd beschouwd als 100%, en het gebied van het specifieke peptide gedeeld door de totale oppervlakte die histon peptide in elk van de gemodificeerde vormen ervan . Histon peptiden aanwezig in een variety van isobaar vormen (Figuur 5). Isobaar peptiden, bijvoorbeeld K18ac en K23ac kan alleen worden gekwantificeerd aan de MS / MS niveau, waar hun unieke fragment ionen worden gebruikt om de verhouding van de isobaar soort (figuur 5A en 5B) te bepalen. Deze verhouding wordt gebruikt om het gebied van de chromatografische piek tussen de twee soorten delen. Bij gebruik van DDA werden deze isobare vormen in een lijst gerichte massa, omdat deze peptiden moeten worden geselecteerd voor fragmentatie door middel van hun volledige elutie, die niet zou plaatsvinden bij een standaard DDA experiment. Discriminatie van de relatieve abundantie van de isobaar soort wordt vervolgens uitgevoerd door het bewaken van het elutieprofiel van de fragment ionen. Aan de andere kant, DIA vorm van verwerving geen insluitingslijst vereist. Dit type van overname methode is niet compatibel met traditionele zoeken in gegevensbanken, en dus mogelijk te voorkomen dat de ontdekking van onbekende gemodificeerde peptiden. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Lysine acetylering (+ 42,011 Da) werd onderscheiden van de bijna isobare trimethylation (+ 42,047 Da) met behulp van hoge resolutie MS overname (> 30.000). Bovendien acetylering is meer hydrofoob dan trimethylation, waardoor elutie van geacetyleerde peptiden uiterlijk op deze trigemethyleerd degenen. De ongemodificeerde vorm van hetzelfde peptide elueert later zelfs door het feit dat de lysine propionylated. Samengevat, de volgorde van de hydrofobiciteit voor een peptide met een aanpasbaar site is di- en trigemethyleerd <geacetyleerde <ongemodificeerde (propionylated) <monomethylated (propionylated). hescs toonde een duidelijke vermindering van geacetyleerde peptiden wanneer gestimuleerd tot differentiatie (figuur 6a en 6b). dit was niet verwonderlijk, want eerdere resultaten gerapporteerd hoger acetylering in ser's vergelijking met differentiëren degenen 25,als gevolg de over het algemeen tolerante karakter pluripotente chromatine. door te focussen op histon h3, werden 35 verschillende gemodificeerde vormen gekwantificeerd 6c). echter, alle proteoforms die kunnen worden onderzocht deze benadering zijn meer dan 200, inbegrip histone varianten modificaties geringe hoeveelheden (gegevens getoond). bovendien onze analyse liet zien dat hoge reproduceerbaarheid kan verkregen tussen technische replicaten, zoals blijkt uit kleine omvang foutbalken (die ± standaarddeviatie). bij elkaar genomen, gedeelte wordt beschreven hoe relatieve rijkdom behulp nlc-ms-gegevens extraheren. figuur 1:. workflow voor ondersteboven ms > Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3:. Making of Stage-kantelen Plug Met een P1000 pipet tip, punch een schijf gemaakt van C18 materiaal uit een vaste fase extractie disk (tweede paneel). De minidisk zal steken in de top (middelste paneel), zodat deze niet kan worden geduwd in een kleinere P100 / 200 pipetpunt met behulp van een soort kleine capillaire. In dit voorbeeld hebben we een 700 urn buitendiameter kwartsglas buis. De minidisk moet worden geduwd naar de onderkant van de P100 / 200 pipet tip totdat het verder (laatste paneel) niet kan gaan. Het podium tip is klaar voor histon ontzouten, want het heeft voldoende capaciteit om voldoende monstermateriaal behouden voor tal van herhalingen. Feitelijk werd een minidisk is voldoende voor 15 – 20 ug sample. Als er meer staal nodig is, kan meerdere schijven worden verpakt op elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4:. Schematische weergave van de DDA en DIA Methoden Bij het ​​gebruik van DDA, de MS scan cyclus wordt gekenmerkt door opeenvolgende selectie van precursorionen voor MS / MS fragmentatie op basis van hun intensiteit en de laadtoestand. Zodra een precursor ion is gefragmenteerd wordt geplaatst in een uitsluitingslijst om herhaalde selectie van hetzelfde peptide voorkomen, zodat de MS "dig" in minder overvloedig signalen. Deze overname methode is de techniek van de keuze in proteomics voor ontdekking mode. Kwantificering wordt bereikt door integreren van de volledige aftastsignaal van een bepaald ion naast de geïdentificeerde MS /MS spectrum. In DIA, wordt de gehele m / z bereik gefragmenteerd bij elke scan cyclus. Deze benadering is minder geschikt voor detectiemodus, maar produceert een chromatografisch profiel van ionen, voorlopers en producten. Dit leidt tot meer vertrouwen kwantificering en discriminatie van isobarisch vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Kwantificering van Isobare peptiden (A) Voorbeeld van twee isobaar peptiden gewoonlijk groot van histon analyse.. De geëxtraheerde ionenchromatogram (XIC) hun precursor massa en relatieve isotopen (hierboven) identiek. De XIC van het product ionen (hieronder) maakt discriminatie van de twee isobaar vormen. Met name dient alleen uniek fragmentionen onsed om de relatieve abundantie van de twee species te schatten. (B) Weergave van de unieke fragmentionen voor de twee beschreven peptiden (in het rood). (C) Lijst van de gewoonlijk geanalyseerde peptiden in Homo sapiens met ten minste één isobaar equivalent. Sequence varianten tussen de genoemde histon peptiden worden aangeduid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: representatieve resultaten van menselijke embryonale stamcellen met en zonder retinoïnezuur Behandeling (A) Relatieve kwantificering van de histon H3 peptide KQLATKAAR (aa 18-26) in al haar gewijzigde proteoforms.. De relatieve rijkdom werd geschat met behulp van alle proteoforms als 100% (de reltieve percentage van het ongemodificeerde peptide wordt niet getoond) (B) Relatieve kwantificatie van het histon H3 peptide KSTGGKAPR (aa 9 -.. 17) (C) Relatieve overvloed gedetecteerde peptiden canonieke histon H3 met en zonder cellen behandeling met retinoïnezuur. De figuur geeft aan in welke van de twee behandelingen de gegeven modificaties overvloediger (> 50%). Over het algemeen, tonen we aan dat histon H3 acetylering dalingen in de meeste van de lysineresten na inductie van celdifferentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Oplossing # Samenstelling 1 Nucleaire isolatiebuffer (NIB) voorraad wordt als volgt gemaakt en ingevroren bewaard als 100 ml aliquots bij -20 ° C; ontdooidNIB kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken: 15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, en 250 mM sucrose. De pH van de buffer wordt ingesteld op 7,5 met HCl. 2 Proteaseremmers (voeg verse buffers voor gebruik): 1 M dithiothreitol (DTT) in DDH 2 O (1000x); 200 mm AEBSF in DDH 2 O (400x) 3 fosfatase inhibitor (voeg vers aan buffers voor gebruik): 2,5 pm Microcystin in 100% ethanol (500x) 4 HDAC-remmer (voeg vers aan buffers voor gebruik): 5 M natrium butyraat, gemaakt door titratie van 5 M boterzuur met behulp van NaOH tot een pH van 7,0 (500x) 5 NP-40 Alternatief: 10% v / v in DDH 2 O 6 0,2 MH 2 SO 4 in DDH 2 O 7 Trichloorazijnzuur (TCA): 100% w / v in DDH 2 O 8 Aceton + 0,1% zoutzuur (HCl): 0,1% v / v HCl in aceton Tabel 1. Solutions.

Discussion

De hier beschreven protocol geoptimaliseerd overweegt kosten, tijd en prestaties. Andere preparaten zijn mogelijk, maar ze hebben beperkingen, vooral bij koppeling met MS analyse. Zo kan de high-zoutwinning protocol worden gebruikt om histonen ²⁶ in plaats van TCA neerslag (deel 3) te zuiveren. Hoge zoutconcentratie protocol intrinsiek milder, omdat niet sterk zuur wordt gebruikt. Zo blijven zuurlabiele PTMs en verhoogt de opbrengst aan geëxtraheerd histonen, zoals TCA precipitatie co-precipitaten vele andere chromatine bindende eiwitten. Echter, hoog-zout extractie leidt tot monsters die te geconcentreerd zout voor HPLC-MS / MS. In een alternatieve opstelling kan histon digestie worden uitgevoerd zonder propionylation (sectie 6-8), bijvoorbeeld door het verminderen trypsine incubatietijd en de enzym / substraat verhouding ²⁷ of via ArgC de spijsvertering enzym ^28-30. Echter, derivatisering met propionzuuranhydride wordt aanbevolen, zoals ikt leidt tot de vorming van meer hydrofobe peptiden, die beter behouden tijdens vloeistofchromatografie.

Chemische derivatisering, hebben een verscheidenheid van organische zuuranhydriden geëvalueerd en het belang ervan uitgebreid besproken ^18. Toch propionzuuranhydride bleek de beste compromis tussen efficiëntie, geminimaliseerde kant producten en verbeterde peptide hydrofobiciteit. Potentieel kan propionzuuranhydride worden gekocht in de isotoop gemerkte vorm; Dit maakt multiplexing analyse door de mogelijkheid van het mengen van meerdere monsters en discrimineren ze de LS wordt op basis van de verschillende massa van de zware verleend label. Echter, deze analyse leidt tot een toenemende complexiteit van de LC-MS chromatogram en vermindert de hoeveelheid monster die geïnjecteerd kan worden voor elke afzonderlijke conditie.

In dit verband moet enkele kritische aspecten van het protocol gemarkeerd. Het volgende dient te worden gebruikt als checklist om fouten te vinden bij het uitvoeren van de procedure in het geval negatieve resultaten worden verkregen. Eerst na precipitatie kernen de pellet zorgvuldig worden gewassen met NIB zonder NP-40 Alternatieve (hoofdstuk 2.10) tot volledige verwijdering van het detergens (zichtbaar door het ontbreken van bellen tijdens het mengen). Niet te doen zou histon extractie met zuren in gevaar brengen. Ten tweede, na histon neerslaan met TCA (paragraaf 3.9) wassen van de pellet met aceton is cruciaal. Aanwezigheid van geconcentreerd zuur zou de volgende stap schadelijk als propionylation en de spijsvertering (paragraaf 6.1) direct worden uitgevoerd. Het zou niet problematisch geval histon fractionering is (deel 5) uitgevoerd zijn. Ten derde is het van essentieel belang dat de propionylation reactie snel wordt uitgevoerd (sectie 6,3-6,7). Om dit te doen, vermijd het gebruik van dezelfde propionylation mix (propionzuuranhydride + acetonitril) voor meer dan 3-4 opeenvolgende monsters. Daarnaast pH is het belangrijkste aspect van trypsine spijsvertering (hoofdstuk 7). Als nietrond 8,0 (7,5-8,5) zal de vertering ineffectief. Dit kan gebeuren wanneer het monster rijk propionzuur in deze stap is. NH ₄ OH kan worden toegevoegd tot nodig. Ook voor onderzoekers bekend zijn met proteomics workflows het normaal zal voelen om het monster te zuren om trypsine spijsvertering te beëindigen. Dit moet niet worden gedaan, omdat het de volgende reactie, dat wil zeggen, propionylation van peptide N-uiteinden (paragraaf 8.1) zal in gevaar brengen. Tenslotte in hetzelfde nummer, is het belangrijk om te onthouden voor gegevensanalyse die ongemodificeerde peptiden eigenlijk ongemodificeerde; allemaal gratis lysine residuen en N-uiteinden zal worden ingenomen door propionylation (56,026 Da). Aldus uitvoeren extraheren ionenchromatografie van de massa die overeenkomt met de unieke peptidesequentie leiden tot geen resultaten.

De beperkingen van de werkwijze houden voornamelijk verband met het onvermogen van het detecteren combinatorische PTMs, door de korte peptidesequenties en de vertekening bij komen tot het abundans van een wijziging, omdat dat peptiden in verschillende gemodificeerde vormen kunnen ioniseren met verschillende efficiënties. Het eerste probleem kan worden opgelost door het combineren van deze techniek met een middle-down of een top-down benadering (besproken in ^16). Dit type analyse, zelfs indien technisch moeilijker is ideaal voor de co-existentie frequenties modificaties. Bovendien maakt een betere discriminatie histone varianten, die niet altijd worden bereikt met bottom-up omdat sommige peptiden dezelfde sequentie in verschillende histon varianten. Het tweede punt, met betrekking tot de ionisatie-efficiëntie, kan worden opgelost met behulp van een bibliotheek van synthetische peptiden ^31. Deze aanpak zorgt voor een nauwkeuriger schatting van de relatieve overvloed van histon PTMs. In de meeste experimenten werd het gewenste resultaat is de relatieve veranderingen van bepaalde aanpassingen tussen geanalyseerde omstandigheden. In dit geval is deze correctie niet noodzakelijk, omdat alle monsters dezelfde bias.

Kortom: dit protocol kan voor de analyse van histon PTMs die in 3 dagen met behulp nLC, gekoppeld met MS kunnen worden voltooid. Vergelijkingen met uitzondering MS technieken, bijvoorbeeld, met behulp van antilichaam gebaseerde strategieën zoals besproken in de inleiding, niet geschikt, omdat ze zelfs bijna het niveau van doorvoer niet kan bereiken. Daarnaast hebben antilichamen gebaseerde technieken niet toe dat ontdekking van nieuwe modificaties, maar uitsluitend gebaseerd op het bevestigen en kwantificeren voorspelde tekens. Wij dus speculeren dat bottom-up proteomics op histon peptiden populariteit in proteomics laboratoria te krijgen als gevolg van de intuïtieve voordelen in het kennen van de regulering van histonen merken, die hoofdrolspelers in tuning genexpressie zijn en dus van invloed op de regulatie van het proteoom. Bovendien beschreef het protocol bevat recente verbeteringen in de steekproef voorbereiding en software voor data-analyse, die histone analyse meer ook triviaal voor labora makenTories die nooit karakterisering van dit soort hypermodified peptiden ervaren.

Materials

Trypsin 0.25% EDTA	Invitrogen	25200056	For harvesting cells
PBS	Invitrogen	14200075
Tris	Roche	77-86-1
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Sodium Chloride	Sigma	S9888
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272
Calcium Chloride, anhydrous	Sigma	C1016
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Invitrogen	15508-013
AEBSF	EMD Millipore Corp	101500
Microcystin	Sigma	M4194
Sodium Butyrate	Sigma	B5887
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)	Fisher Scientific	78445
NP-40 Alternative	CALBIOCHEM	492016
Sulfuric Acid, ACS grade	Fisher Chemical	7664-93-9
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
Acetone	Sigma	179124
HCl	Fisher Chemical	A144-500
Bradford reagent	Biorad	500-0006
30% acrylamide/bis 29:1 — 500ml	Biorad	1610156
Coomassie	Fisher Scientific	20278
C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm	Grace	218TP52
C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm	Grace	218TP54
HPLC grade acetonitrile	Fisher Chemical	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Ammonium Bicarbonate	Sigma	A6141
ammonium hydroxide	Sigma	338818
propionic anhydride	Sigma	240311
Sequencing grade modified trypsin	Promega	PRV5113	For digesting histones for MS
Acetic Acid	Sigma	49199
C18 extraction disk	Empore	2215
Formic Acid	Sigma	F0507