Denne artikel beskriver high-throughput assay, som er blevet etableret for at screene store biblioteker af små molekyler for deres potentielle evne til at manipulere cellulære niveauer af cyclisk di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, hvilket giver en ny kraftfuldt værktøj til antibakteriel lægemiddelforskning og forbindelse testning.
Bakteriel resistens over for traditionelle antibiotika har drevet forskning forsøg på at identificere nye lægemiddelkandidater i for nylig opdaget regulatoriske veje. Regulatoriske systemer, der udnytter intracellulær cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en anden messenger er en sådan klasse af målet. c-di-GMP er et signalmolekyle findes i næsten alle bakterier, der virker til at regulere en lang række processer, herunder antibiotisk resistens, biofilmdannelse og virulens. Forståelsen af, hvordan c-di-GMP signalering kontrol aspekter af antibiotikaresistente biofilm udvikling har foreslået fremgangsmåder, hvorved ændring af de cellulære koncentrationer af nukleotidet eller forstyrrelser af disse signalveje kan medføre reduceret biofilmdannelse eller øget følsomhed af biofilm til antibiotika. Vi beskriver en simpel high-throughput bioreporter protokol, baseret på grønt fluorescerende protein (GFP), hvis ekspression er under kontrol af c-di-GMP responsiv promotor CDRA, Hurtigt at screene for små molekyler med potentiale til at modulere c-di-GMP cellulære niveauer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denne enkle protokol kan screene op mod 3.500 forbindelser inden for 48 timer og har evnen til at blive tilpasset til flere mikroorganismer.
Den hurtige udvikling af bakteriel resistens mod klinisk vigtige antibiotika er en af de største bekymringer i øjeblikket står over sundhedspersonale verden over. Dette svigt af traditionelle antibiotika har drevet nye søgninger på kemisk stof, der kan interferere med bakterielle processer involveret i virulens og sygdomsprogression 1. Et sådant reguleringssystem, der udnytter den intracellulære second messenger cykliske di-GMP (c-di-GMP) for nylig er blevet et mål med lovende gyldighed 2-4. Det er blevet fastslået, at denne globale second messenger signalmolekyle regulerer mange funktioner, herunder antibiotisk resistens, vedhæftning, biofilmdannelse og sygdom 2-4.
Det er nu klart, at det cellulære niveau af c-di-GMP i bakteriecellen styres af syntese og nedbrydning, hvorved to molekyler af GTP anvendes til at syntetisere c-di-GMP ved GGDEF domæne-holdige diguanylate cyclaser (DGCs) whereas c-di-GMP nedbrydning katalyseres af (PDE'er), som har enten en EAL eller en HD-GUF domæne (revideret i (3, 5)). Proteiner, der indeholder disse domæner indeholder ofte andre signalering domæner, hvilket tyder på, at deres aktivitet i c-di-GMP omsætning reguleres enten direkte eller indirekte af miljø- eller cellulære 3,5 stikord. Følgelig c-di-GMP signalering funktioner til at forbinde sensing af forskellige miljømæssige påvirkninger for ændringer i bakteriel fænotype. c-di-GMP udøver sin regulerende virkning i bakterier på niveauet for transkription, post-transkription og post-translation ved forskellige mekanismer 4.
En stor indflydelse af c-di-GMP i mange bakterieceller er i bestemmelsen af bakterielle 'livsstil «og navnlig i kontrollen af overgange mellem motile planktoniske celler og fastsiddende celler fastgjort til overflader eller afholdes i de flercellede strukturer af biofilm 3,5. Generelt høj cellulærniveauer af c-di-GMP er forbundet med biofilm dannelse og sessility, mens lave cellulære niveauer fremmer motilitet og virulensfaktor syntese i mange bakterielle patogener 3,5. Således kunne en mere detaljeret viden om arbejdet i c-di-GMP signalering råd strategier for hæmning af biofilm dannelse og virulens i bakterielle patogener. Dette er en skræmmende opgave, da de fleste bakterielle genomer indkode mange proteiner med GGDEF, EAL og / eller HD-GUF domæner (fx P. aeruginosa har over 40 proteiner) og flere effektorer 6,7.
Selv med denne kompleksitet, nye oplysninger tyder dog, at strategier manipulere c-di-GMP-signalering kan udvikles til enten at forhindre antibiotikaresistente infektioner udvikle eller gøre dem modtagelige for immunsystemet eller effektiv behandling ved co-administration af klassiske antibiotika 2. I tråd med dette, er det blevet eksperimentelt påvist, at kunstig faldaf intracellulær c-di-GMP i in vitro -grown P. aeruginosa fører til nedsat biofilm dannelse og øget følsomhed over for antimikrobielle stoffer, mens P. aeruginosa -developed biofilm på silikoneimplantater, som ligger i den peritoneale kavitet hos mus, kan dispergeres i en tilsvarende måde 8-11.
Her beskriver vi en high-throughput, fluorescens-baserede reporter assay til screening små molekyler, der potentielt kan modulere de cellulære c-di-GMP-niveauer i P. aeruginosa (figur 1). Bestemmelsen er baseret på måling af C-di-GMP cellulære niveauer ved hjælp af en tidligere udviklet GFP reporter, hvis ekspression transkriptionelt koblet til C-di-GMP-responsiv CDRA promotor 12. Denne protokol beskriver metoden til ekspression af reporter-konstruktionen i P. aeruginosa stamme af interesse, sammensatte plade forberedelse, kultur inokulering i 384-brønds plader, vækstbetingelser, som vill som oplysninger om indsamling, forvaltning og analyse (figur 1) data. Samlet set vil denne protokol hjælpe forskerne til potentielt identificere nye forbindelser målrettet c-di-GMP signalering i bakterier, og til brug i forskning, der sigter på at forstå biologi P. aeruginosa.
For at forbedre behandlingen af bakterielle infektioner, er det klart, at en bedre forståelse af bakteriel adfærd på det molekylære reguleringsniveau er påkrævet. Den her beskrevne procedure vil være til gavn for mikrobiologer, biokemikere og klinikere, der ønsker at afdække små molekyler, der har potentiale til at manipulere eller forstyrre cellulære koncentrationer af c-di-GMP i bakterier. Fremgangsmåden anvender en nylig udviklet GFP bioreporter at overvåge cellulære niveauer af c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Denne bioreporter er valideret og vist vigtigere ikke at påvirke væksten af stammen bruges, når de dyrkes i 5% LB i PBS. Anvendelsen af en hel-celle skærmen for at identificere små molekyler, som ændrer c-di-GMP-niveauer in vivo overvinder de største problemer i target-baserede lægemiddelforskning i form af molekyle penetration gennem de bakterielle membraner, især ved de af gramnegative bakterier . Vigtigere, than assay synes meget robust som en robust z 'værdi konsekvent over 0,5 blev observeret i alle skærmbilleder til dato. Screening ved hjælp af denne protokol vil afsløre en række af små molekyler, der hæmmer og / eller fremmer intracellulære c-di-GMP-niveauer i P. aeruginosa. Desuden dette assay har også potentiale til at identificere baktericide eller bakteriostatiske forbindelser resulterer i et fald i OD600 udlæsning.
Selv om det ikke diskuteres i protokollen sektion, der er flere vigtige overvejelser til fremstilling af eksperimentet. Det er vigtigt at huske på, at GFP bioreporter er baseret på et plasmid. Selv reporterplasmidet er kendt for at være meget stabil i P. aeruginosa, kan det være tabt efter kontinuerlig re-plating, hvorfor det er nødvendigt at bruge frisk forgyldt stammer fra en -80 ° C glycerol lager, og kontrollere fluorescens udtryk er kritisk. Det er også meget værdifuldt at bevare ensartede vækstbetingelser hele skærmenda eventuelle udsving i disse betingelser kunne have afsmittende virkninger på skærmen. Dette vil omfatte gøre sikkert, at medier og antibiotika er premade i batch og anvendes i hele forløbet af skærmen. Bakteriekulturer ikke vokser (baseret på OD600 udlæsninger) på en ensartet måde er et fælles problem for de fleste high-throughput skærme af denne art. Dette kan skyldes randeffekter eller afgivelse af en ikke-homogen bakteriekultur i pladerne. For den førstnævnte, og sørg en gas-gennemtrængelige segl der anvendes under inkubationen er afgørende. Mens for sidstnævnte, priming væskehåndteringsudstyret rør, med et volumen af kulturen mindst tre gange anbefales det døde volumen af selve slangen. Det er afgørende at holde magnetomrører ved minimal hastighed under dispensering. Mens overvågning og lagring af de 384-brønds plader til konsistent vækst i løbet af forsøgene er altafgørende, en situation at undgå, er stabling af plader under inkubation, da det kan forårsage unønskede ilt gradienter fører til en skævhed i vækstmønster. Det er også vigtigt at sikre, at DMSO-vehikel anvendes som en negativ kontrol ikke er negativ indvirkning vækst af stammen af interesse. Mange af disse problemer forbundet med vækst kan undgås ved at udføre en mock skærm med den bakterielle stamme af interesse forud for screening. Data fortolkning også fortjener overvejelse eftersom c-di-GMP hæmning resultater beregnes ved ændringen i arbitrære fluorescens intensitet enheder, der skal korrigeres for ændringen i celle tæthed. Med dette i tankerne forskellige matematiske formler til at vurdere data output fra disse eksperimenter bør også overvejes. For eksempel kan en forbindelse vist som en c-di-GMP-inhibitor, men faktisk være en vækst inhibitor eller omvendt, trænger forsigtig fortolkning af identificerede hits.
Der er flere ulemper og begrænsninger, der skal overvejes under udviklingen og opfyldelsen af dennehigh-throughput cellebaserede skærm. For eksempel bio-reporter funktioner på et indirekte mål for cellulære c-di-GMP-niveauer under anvendelse af en fluorescerende probe, hvis afsløring egenskaber kunne potentielt blive påvirket af små molekyler, der anvendes i en skærm. En tangentiel problem er, at det cellebaserede assay giver ingen oplysninger om mekanismen bag ændringer i niveauerne af intracellulær c-di-GMP. Derfor skal vigtige iagttagelser fra forsøg bekræftes ved anvendelse af et højtydende væskekromatografi-massespektrometri tilgang, som betragtes som den "guldstandard" metode til måling af intracellulære c-di-GMP udsving i bakterier. Endvidere kan vores procedure kun tilvejebringe oplysninger om opførslen af bakterier dyrket in vitro, som bakterieceller dyrkes i forbindelse med værten (in vivo) hurtigt ændre deres aktiviteter på grund af dette miljø. Endvidere processen med at bruge en GFP bioreporter betyder, skærmen ikke tagerhensyn til den fysiologiske status af bakteriecellerne. Imidlertid kunne den protokol tilpasses til mikroskopisk overvågning af individuelle brønde i løbet af skærmen.
Selv med disse overvejelser og begrænsninger, denne high-throughput assay er stadig et robust skærm for små molekyler, der kan interferere med intracellulære c-di-GMP-niveauer. Da mange mikrobielle arter, herunder mange bakterielle patogener er blevet undersøgt for at karakterisere modulation af intracellulære c-di-GMP-niveauer, kan vores protokol anvendes på forskellige bakteriearter og udvidet til studiet af mere komplekse flere arter bakterier modeller. Assayet kan let optimeres til andre bakteriearter ved at ændre de anvendte vækstbetingelser, eller kan være indrettet til at læse andre udgange ved hjælp af forskellige bioreporters. Forskellige inkubationstider kan anvendes afhængigt af vækstfasen af interesse. Men når opskalering eller øge gennemgående put, det er importan t at huske på, at bakterierne stadig vil være voksende under plade præparater og læse-målinger. Derfor anbefales det at screene maksimalt 15 plader ad gangen ved hjælp af denne protokol. Desuden bruger plader med mere end 384 brønde kan ikke tillade en ensartet vækst, kræver yderligere optimering. Når skalering ned på antallet af plader, kan det være mere hensigtsmæssigt at manuelt pode bruger en elektronisk pipette i stedet for en flydende håndtering robot. Det er klart, at denne protokol kan anvendes til at undersøge små molekyler som spreder biofilm, da anti-biofilm forbindelser forstyrrer c-di-GMP signalering. Protokollen kan også tilbygges at forstå forskellige aspekter af bakteriel fysiologi. Da c-di-GMP-signalering er udbredt i de fleste bakterier, ved at studere fysiologier af disse organismer ved hjælp af denne protokol vi kan identificere forskellige kemiske stimuli til at afgøre, hvorvidt deres arbejdsmetoder mekanismer kræver c-di-GMP-signalering.
_content "> Sammenfattende vil robusthed og alsidighed af den foreslåede fremgangsmåde i denne protokol hjælpe identifikationen af kemiske modulatorer af c-di-GMP signalering i mange biologiske systemer.The authors have nothing to disclose.
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |