إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em> الزائفة الزنجارية</em
Summary
توضح هذه المقالة مقايسة الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة لقدرتها المحتملة على التعامل مع مستويات الخلايا من دوري دى GMP في الزائفة الزنجارية، وتوفير أداة قوية جديدة لاكتشاف الأدوية المضادة للبكتيريا والاختبار المجمع.
Abstract
وأدت مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية التقليدية محاولات الأبحاث لتحديد الأهداف المخدرات الجديدة في مسارات التنظيمية التي اكتشفت مؤخرا. النظم التنظيمية التي تستخدم الخلايا دوري دى GMP (ج-دي-GMP) كرسول الثاني هي واحدة من الدرجة مثل هذه الهدف. ج-دي-GMP هو جزيء إشارة وجدت في كل البكتيريا تقريبا التي تعمل على تنظيم مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك المقاومة للمضادات الحيوية، وتشكيل بيوفيلم والفوعة. وقد اقترح فهم كيفية ج-دي-GMP يشير الضوابط جوانب التنمية بيوفيلم مقاومة للمضادات الحيوية، نهج يمكن تغيير تركيزات الخلوية من النوكليوتيدات أو تعطيل هذه مسارات إشارات قد يؤدي إلى انخفاض تشكيل بيوفيلم أو زيادة حساسية الأغشية الحيوية للمضادات الحيوية. وصفنا بسيط بروتوكول الإنتاجية العالية bioreporter، بناء على البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، والذي يظهر تحت سيطرة ج-دي-GMP المروج استجابة CDRA، للكشف بسرعة عن جزيئات صغيرة مع إمكانية لتعديل مستويات الخلايا ج-دي-GMP في الزائفة الزنجارية (الزائفة الزنجارية). هذا البروتوكول بسيطة يمكن أن يحجب ما يزيد عن 3500 مركبات غضون 48 ساعة، ولديه القدرة على أن تتكيف الكائنات الحية الدقيقة متعددة.
Introduction
التطور السريع للمقاومة البكتيريا ضد المضادات الحيوية الهامة سريريا هي واحدة من الاهتمامات الرئيسية التي تواجه العاملين في مجال الصحة في جميع أنحاء العالم. وقد أدى هذا الفشل من المضادات الحيوية التقليدية تفتيش جديدة لمسألة الكيميائية التي يمكن أن تتداخل مع عمليات بكتيرية تشارك في الفوعة وتقدم المرض 1. واحد مثل هذا النظام التنظيمي الذي يستخدم داخل الخلايا رسول الثاني دوري دى GMP (ج-دي-GMP) في الآونة الأخيرة أصبحت هدفا مع صحة واعدة 2-4. وقد ثبت أن هذا الجزيء الثاني رسول إشارة العالمي ينظم العديد من المهام بما في ذلك المقاومة للمضادات الحيوية، التصاق، تشكيل بيوفيلم والمرض 2-4.
ومن المفهوم الآن أن يتم التحكم في مستوى الخلية من ج-دي-GMP في الخلية البكتيرية عن طريق التخليق والتدهور التي تستخدم فيها اثنين من جزيئات GTP لتجميع ج-دي-GMP من قبل GGDEF التي تحتوي على نطاق cyclases diguanylate (DGCs) WHيتم تحفيز ereas ج-دي-GMP التحلل بواسطة phosphodiesterases (المعادلات التفاضلية الجزئية) التي لديها إما EAL أو مجال HD-GYP (إعادة النظر في (3، 5)). البروتينات التي تحتوي على هذه المجالات غالبا ما تحتوي على المجالات مما يشير إلى أخرى، مما يشير إلى أن نشاطهم في دوران ج-دي-GMP ينظم إما بشكل مباشر أو غير مباشر عن طريق الاشارات البيئية أو الخلوية 3،5. ونتيجة لذلك، ج-دي-GMP يشير ظائف لربط الاستشعار من الاشارات البيئية المتنوعة إلى تعديلات في النمط الظاهري البكتيرية. ج-دي-GMP يمارس تأثيره التنظيمي في البكتيريا على مستوى النسخ، بعد النسخ وبعد الترجمة من قبل مختلف الآليات 4.
وهناك تأثير كبير للج-دي-GMP في العديد من الخلايا البكتيرية في تحديد "نمط الحياة" البكتيرية، وعلى وجه الخصوص، في السيطرة على الانتقال بين الخلايا العوالق متحركة وخلايا اطئة تعلق على الأسطح أو تنظيمها في هياكل متعددة الخلايا من الأغشية الحيوية 3،5. بشكل عام، وارتفاع الخلويةوترتبط مستويات ج-دي-GMP مع تشكيل بيوفيلم وsessility، في حين تشجع مستويات الخلايا انخفاض القدرة على الحركة وتكوين عوامل الفوعة في العديد من مسببات الأمراض البكتيرية 3،5. وهكذا، يمكن معرفة أكثر تفصيلا للعمل من ج-دي-GMP إشارات تحمل استراتيجيات لتثبيط تشكيل بيوفيلم والفوعة في مسببات الأمراض البكتيرية. وهذه مهمة شاقة بالنظر إلى أن معظم العوامل الوراثية البكتيرية ترميز العديد من البروتينات مع GGDEF، الخطوط الجوية الاثيوبية و / أو المجالات HD-GYP (على سبيل المثال الزائفة الزنجارية لديها أكثر من 40 البروتينات) ومؤثرات متعددة 6،7.
ولكن، حتى مع هذا التعقيد، وتشير أدلة حديثة إلى أن استراتيجيات التلاعب ج-دي-GMP إشارات قد تكون وضعت إما منع العدوى المقاومة للمضادات الحيوية النامية أو جعلها عرضة لجهاز المناعة أو علاج فعال عن طريق المشاركة في إدارة المضادات الحيوية الكلاسيكية 2. وتماشيا مع هذا، فقد ثبت بالتجربة أن انخفاض الاصطناعيمن الخلايا ج-دي-جي إم بي في في المختبر -grown P. الزنجارية يؤدي إلى انخفاض تشكيل بيوفيلم وزيادة التعرض للمضادات الحيوية، في حين P. الزنجارية -developed الأغشية الحيوية على زرع السيليكون، وتقع في التجويف البريتوني من الفئران، ويمكن أن تكون مشتتة بطريقة مماثلة 8-11.
هنا، نحن تصف الإنتاجية العالية، القائم على مضان مراسل فحص لفحص الجزيئات الصغيرة التي يمكن ان تعدل مستويات ج-دي-GMP الخلوية في P. الزنجارية (الشكل 1). ويستند هذا الفحص على قياس ج-دي-GMP مستويات الخلايا باستخدام وضعت سابقا مراسل GFP التي يرتبط transcriptionally إلى CDRA المروج ج-دي-GMP المراعية 12 التعبير. يصف هذا البروتوكول منهجية للتعبير عن التركيبة مراسل في P. الزنجارية سلالة من الفائدة، وإعداد لوحة مركب، التلقيح الثقافة في لوحات 384 جيدا، وظروف النمو، ونحنليرة لبنانية عن تفاصيل بشأن جمع البيانات وإدارتها وتحليلها (الشكل 1). وعموما، فإن هذا البروتوكول تساعد الباحثين على تحديد يحتمل أن تكون المركبات رواية تستهدف ج-دي-GMP يشير في البكتيريا، ولاستخدامها في الأبحاث تهدف إلى فهم بيولوجيا P. الزنجارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل تحسين علاج الالتهابات البكتيرية، فمن الواضح أن فهم أفضل لسلوك البكتيريا على المستوى التنظيمي الجزيئي هو مطلوب. فإن الإجراء الموضح هنا تكون مفيدة لعلماء الأحياء المجهرية، الكيمياء الحيوية والأطباء الذين يرغبون في الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي لديها القدرة على التلاعب أو التدخل مع تركيزات الخلوية ج-دي-جي إم بي في البكتيريا. طريقة يستخدم وضعت مؤخرا bioreporter GFP لمراقبة مستويات الخلايا من ج-دي-جي إم بي في بي الزنجارية 12. وقد تم التحقق من صحة هذه bioreporter وأظهرت الأهم لا تؤثر على نمو السلالة المستخدمة عند المثقف في 5٪ LB في برنامج تلفزيوني. استخدام شاشة خلية كاملة لتحديد جزيئات صغيرة أن يغير مستويات ج-دي-GMP في الجسم الحي يتغلب على الصعوبات الكبرى من اكتشاف المخدرات القائم على الهدف من حيث اختراق جزيء من خلال الأغشية البكتيرية، لا سيما من خلال تلك البكتيريا سالبة الجرام . الأهم من ذلك، رانه فحص يبدو قويا جدا كقيمة قوية ض 'باستمرار فوق لوحظ 0.5 في جميع الشاشات حتى الآن. فحص باستخدام هذا البروتوكول سوف تكشف عن وجود عدد من الجزيئات الصغيرة التي تمنع و / أو تعزيز مستويات ج-دي-GMP الخلايا في P. الزنجارية. وعلاوة على ذلك، يحتوي هذا الاختبار أيضا القدرة على تحديد جراثيم أو مركبات للجراثيم مما أدى إلى انخفاض في OD 600 قراءة المغادرة.
على الرغم من عدم مناقشته في القسم البروتوكول، وهناك عدة اعتبارات هامة لإعداد التجربة. ومن الأهمية بمكان أن نضع في اعتبارنا أن يستند bioreporter GFP على البلازميد. على الرغم من البلازميد مراسل هو معروف أن تكون مستقرة جدا في P. الزنجارية، فإنه يمكن أن تضيع بعد المستمر إعادة الطلاء، وبالتالي الحاجة إلى استخدام سلالات مطلية حديثا من -80 ° C الأسهم الجلسرين، والتحقق من التعبير مضان أمر بالغ الأهمية. بل هو أيضا قيمة للغاية للحفاظ على ظروف النمو موحدة في جميع أنحاء الشاشةلأن أي تقلبات في هذه الظروف يمكن أن يكون لها آثار ضرب على على الشاشة. ويشمل ذلك التأكد من أن وسائل الإعلام والمضادات الحيوية هي ولم يضف دفعة واحدة واستخدمت طوال الشاشة. الثقافات البكتيرية لا ينمو (على أساس OD 600 قراءة الرافضة) بطريقة موحدة هي قضية مشتركة لمعظم شاشات عالية الإنتاجية من هذا النوع. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى حافة الآثار أو الاستغناء ثقافة البكتيرية غير متجانسة في لوحات. عن السابق، والتأكد من ختم المنفذة للغازات يستخدم أثناء الحضانة أمر حيوي. في حين لهذا الأخير، فتيلة أنابيب معالج السائل مع حجم ثقافة ما لا يقل عن ثلاث مرات وأوصى حجم القتلى من الأنبوب نفسه. ومن الأهمية بمكان للحفاظ على محرك مغناطيسي بأقل سرعة خلال الاستغناء. في حين رصد وتخزين لوحات 384 جيدا لنمو ثابت على مدار التجارب هو الهدف الأسمى، وهو وضع لتفادي هو التراص لوحات أثناء الحضانة لأنها يمكن أن تسبب الامم المتحدةأراد التدرجات الأكسجين مما يؤدي إلى انحراف في نمط النمو. ومن المهم أيضا لضمان أن السيارة DMSO تستخدم كعنصر تحكم السلبية لا تؤثر سلبا على النمو من سلالة من الفائدة. العديد من هذه القضايا المرتبطة بالنمو يمكن تجنبها عن طريق إجراء الشاشة وهمية مع سلالة بكتيرية من الفائدة قبل الفحص. تفسير البيانات أيضا اقتراح جدير بالنظر بالنظر إلى أن تحسب النتائج تثبيط ج-دي-GMP من التغيير في وحدات كثافة مضان التعسفية التي يجب تصحيحها للتغيير في كثافة الخلية. مع هذا في الاعتبار الصيغ الرياضية المختلفة لتقييم بيانات الناتج من هذه التجارب ينبغي النظر أيضا. على سبيل المثال، قد يظهر مركب كمانع ج-دي-GMP ولكن في الواقع ان يكون المانع النمو أو العكس بالعكس، مما يتطلب تفسير الحكمة من الزيارات التي تم تحديدها.
وهناك العديد من العوائق والقيود التي يجب مراعاتها أثناء وضع وأداء هذهإنتاجية عالية خلية القاعدة الشاشة. على سبيل المثال، وظائف مراسل الحيوي على مقياس غير مباشر من مستويات ج-دي-GMP الخلوية باستخدام مسبار الفلورسنت التي يحتمل أن تتأثر الجزيئات الصغيرة المستخدمة في شاشة خصائص الكشف. وهناك مسألة عرضية هو حقيقة أن فحص خلية القاعدة يعطي أي معلومات بشأن آلية وراء التغيرات في مستويات الخلايا ج-دي-GMP. لذلك، لا بد من تأكيد الملاحظات الهامة من التجارب باستخدام السائل نهج الطيف اللوني الشامل عالية الأداء، والتي تعتبر طريقة "الذهب القياسية" لقياس الخلايا تقلبات ج-دي-جي إم بي في البكتيريا. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء دينا فقط توفير المعلومات بشأن سلوك البكتيريا نما في المختبر، كما نمت الخلايا البكتيرية في سياق المضيف (في الجسم الحي) بسرعة تعديل أنشطتها بسبب هذه البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن عملية باستخدام bioreporter GFP تعني الشاشة لا يأخذبعين الاعتبار الحالة الفسيولوجية للخلايا البكتيرية. ومع ذلك، يمكن تكييفها على بروتوكول لمراقبة مجهرية من الآبار الفردية خلال الشاشة.
حتى مع هذه الاعتبارات والقيود، وهذا الاختبار عالية الإنتاجية لا يزال شاشة قوية لجزيئات صغيرة قادرة على التدخل في مستويات ج-دي-جي إم بي داخل الخلايا. منذ العديد من الأنواع الميكروبية بما في ذلك العديد من مسببات الأمراض البكتيرية تم دراستها من أجل تميز تعديل مستويات ج-دي-جي إم بي داخل الخلايا، ويمكن تطبيق بروتوكول لدينا إلى الأنواع البكتيرية المختلفة وتوسيعها لدراسة نماذج البكتيريا المتعددة الأنواع الأكثر تعقيدا. الفحص يمكن أن يكون الأمثل بسهولة الأنواع البكتيرية الأخرى عن طريق تغيير ظروف النمو المستخدمة، أو يمكن تكييفها لقراءة مخرجات أخرى باستخدام bioreporters مختلفة. ويمكن تطبيق حضانة مرات مختلفة تبعا لمرحلة النمو من الفائدة. ومع ذلك، عندما التصعيد أو زيادة خلال-وضعت، فمن الاهميه ر أن نضع في اعتبارنا أن البكتيريا ستظل تنمو خلال الاستعدادات لوحة والقياسات تلا. ولذلك فمن المستحسن أن يحجب بحد أقصى 15 لوحات في وقت واحد باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام لوحات مع أكثر من 384 بئرا قد لا تسمح النمو موحد، وتحتاج إلى مزيد من التحسين. عندما تقليص عدد لوحات، وأنه قد يكون من الأنسب لتطعيم يدويا باستخدام ماصة الإلكترونية بدلا من الروبوت معالجة السائل. ومن الواضح أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للتحقيق في جزيئات صغيرة تفريق الأغشية الحيوية، بالنظر إلى أن المركبات المضادة للبيوفيلم تتداخل مع ج-دي-GMP الإشارات. ويمكن أيضا أن يتم إعادة تطوير بروتوكول لفهم الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء البكتيرية. وبالنظر إلى أن الإشارات ج-دي-GMP هي السائدة في معظم البكتيريا، من خلال دراسة physiologies من هذه الكائنات باستخدام هذا البروتوكول يمكننا التعرف على المحفزات الكيميائية المختلفة لتحديد ما إذا كان أو لم يكن آليات عملها تتطلب ج-دي-GMP الإشارات.
_content "> وباختصار، فإن متانة وبراعة النهج الواردة في هذا البروتوكول سوف تساعد في تحديد جهري الكيميائية ج-دي-GMP يشير في كثير من النظم البيولوجية.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Materials
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
| 100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
- Lewis, K. Recover the lost art of drug discovery. Nature. 485, 439-440 (2012).
- Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?. Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signaling in bacteria. Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).
- Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. When the PilZ don’t work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria. Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).
- Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).
- Boyd, C. D., GA, O. ‘. T. o. o. l. e. Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems. Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).
- Ryan, R. P., et al. HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).
- Christensen, L. D., et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria. Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Comm. 5, (2014).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation. Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development. Biofouling. 30, 17-28 (2014).
- Rybtke, M. T., et al. Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa. App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).
