Hautement sensible et rapide avec détection par fluorescence avec un analyseur FRET Portable

Résumé

Ce protocole décrit la quantification rapide et très sensible de Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) des données de capteur en utilisant un analyseur portable FRET-mesure. Le dispositif a été utilisé pour détecter le maltose dans une plage de température critique qui maximise la sensibilité de détection, ce qui permet une évaluation pratique et efficace de la teneur en sucre.

Résumé

De récentes améliorations dans Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) capteurs ont permis leur utilisation pour détecter diverses petites molécules, y compris des ions et des acides aminés. Cependant, l'inné faible intensité du signal des capteurs FRET est un défi majeur qui empêche leur application dans divers domaines et rend l'utilisation de coûteux, haut de gamme Fluorimètres nécessaire. Auparavant, nous avons construit une haute performance FRET analyseur rentable qui peut spécifiquement mesurer le rapport de deux bandes de longueur d'onde d'émission (530 et 480 nm) pour obtenir une sensibilité de détection élevée. Plus récemment, on a découvert que les capteurs FRET avec des protéines de liaison périplasmique bactérienne détectent les ligands ayant une sensibilité maximale dans la plage de température critique de 50 - 55 ° C. Ce rapport décrit un protocole d'évaluation de la teneur en sucre dans des échantillons de boissons disponibles dans le commerce en utilisant notre FRET analyseur portable avec un capteur de FRET spécifique à la température. Nos résultats ont montré que le préchauffage supplémentaireProcédé de la sonde FRET augmente sensiblement le rapport signal FRET pour permettre une mesure plus précise de la teneur en sucre. Le FRET analyseur et le capteur sur mesure ont été appliquées avec succès pour quantifier la teneur en sucre dans trois types de boissons commerciales. Nous prévoyons que la poursuite de la réduction de la taille et amélioration de la performance de l'équipement facilitera l'utilisation d'analyseurs portatifs dans des environnements où l'équipement haut de gamme ne sont pas disponibles.

Introduction

Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) a été largement utilisée comme un capteur biométrique pour détecter de petites molécules telles que des sucres, des ions calcium et des acides aminés ^1-4. biocapteurs FRET contiennent des protéines fluorescentes, des protéines fluorescentes cyan (PFC) et des protéines fluorescentes jaunes (YFPs), qui sont fusionnés aux deux extrémités des protéines périplasmiques de liaison (PLP). Les sucres se lient aux PLP situées au milieu de la sonde FRET, ce qui provoque des modifications structurelles au capteur qui modifie ensuite l'orientation et la distance de transition dipolaire des deux protéines fluoresc....

Protocole

1. Préparation de biocapteur

1. Construire le plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 en suivant le protocole précédemment établi ^2.
2. Inoculer 5 ml de bouillon Luria (LB) avec une seule colonie d'une souche Escherichia coli DE3 et incuber à 37 ° C pendant 16 heures avec agitation.
3. Le transfert de 1 ml de la culture O / N dans un ballon de 500 ml contenant 100 ml de LB et on incube à 37 ° C dans un incubateur agité jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ atteint 0,5 (environ 3 heures).
4. Récolter les cellules dans un tube conique de 50 ml par centrifugation à 1000 xg pendant 20 min à ....

Résultats

Pour effectuer une analyse quantitative de la teneur en sucre en utilisant l'analyseur FRET, il est nécessaire de construire une courbe ajustée estimation de la concentration en sucre cible à partir du rapport FRET observé. Soit r définir le rapport entre l'intensité d'émission de CFP à 480 nm et l'intensité d'émission de la YFP générée à 530 nm (éq. 1).

Discussion

Ce protocole permet une quantification rapide et efficace de la teneur en sucre dans les échantillons de boisson, au moyen d' un sur-mesure de FRET analyseur ⁷ à une température optimale pour les capteurs FRET. L'analyseur a été conçu avec un récemment mis au point, peu coûteux 405 nm bande ultra-violet LED comme source lumineuse et deux photodétecteurs avec une photodiode au silicium. Ce dispositif est plus rentable que les autres fluorimétres comparables. Le dispositif a montré une sensibilité de dé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LB	BD	#244620
isopropyle &beta ;-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicilline	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4
SOC			2 % tryptone, 0,5 % Extrait de levure, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM
Glucose Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 & times ; 30 mm colonne de chromatographie par échange d’anions  ;
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Cuvette en quartz	Sigma	Z802875
AKÄ ; KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	une chromatographie liquide protéique rapide (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		un spectrophotomètre à fluorescence
VICTOR  ;   ;	PerkinElmer	2030-0050	un lecteur de plaques multi-étiquettes
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent
cells A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft
drink C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink