Hautement sensible et rapide avec détection par fluorescence avec un analyseur FRET Portable
Summary
Ce protocole décrit la quantification rapide et très sensible de Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) des données de capteur en utilisant un analyseur portable FRET-mesure. Le dispositif a été utilisé pour détecter le maltose dans une plage de température critique qui maximise la sensibilité de détection, ce qui permet une évaluation pratique et efficace de la teneur en sucre.
Abstract
De récentes améliorations dans Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) capteurs ont permis leur utilisation pour détecter diverses petites molécules, y compris des ions et des acides aminés. Cependant, l'inné faible intensité du signal des capteurs FRET est un défi majeur qui empêche leur application dans divers domaines et rend l'utilisation de coûteux, haut de gamme Fluorimètres nécessaire. Auparavant, nous avons construit une haute performance FRET analyseur rentable qui peut spécifiquement mesurer le rapport de deux bandes de longueur d'onde d'émission (530 et 480 nm) pour obtenir une sensibilité de détection élevée. Plus récemment, on a découvert que les capteurs FRET avec des protéines de liaison périplasmique bactérienne détectent les ligands ayant une sensibilité maximale dans la plage de température critique de 50 – 55 ° C. Ce rapport décrit un protocole d'évaluation de la teneur en sucre dans des échantillons de boissons disponibles dans le commerce en utilisant notre FRET analyseur portable avec un capteur de FRET spécifique à la température. Nos résultats ont montré que le préchauffage supplémentaireProcédé de la sonde FRET augmente sensiblement le rapport signal FRET pour permettre une mesure plus précise de la teneur en sucre. Le FRET analyseur et le capteur sur mesure ont été appliquées avec succès pour quantifier la teneur en sucre dans trois types de boissons commerciales. Nous prévoyons que la poursuite de la réduction de la taille et amélioration de la performance de l'équipement facilitera l'utilisation d'analyseurs portatifs dans des environnements où l'équipement haut de gamme ne sont pas disponibles.
Introduction
Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) a été largement utilisée comme un capteur biométrique pour détecter de petites molécules telles que des sucres, des ions calcium et des acides aminés 1-4. biocapteurs FRET contiennent des protéines fluorescentes, des protéines fluorescentes cyan (PFC) et des protéines fluorescentes jaunes (YFPs), qui sont fusionnés aux deux extrémités des protéines périplasmiques de liaison (PLP). Les sucres se lient aux PLP situées au milieu de la sonde FRET, ce qui provoque des modifications structurelles au capteur qui modifie ensuite l'orientation et la distance de transition dipolaire des deux protéines fluorescentes à chaque extrémité de la PLP. Cette modification permet une analyse quantitative de la teneur en sucre en mesurant le rapport des longueurs d'onde d'émission de l'EYFP (530 nm) et ECFP (480 nm). En raison de la haute sensibilité, la spécificité, la capacité de surveillance en temps réel, et le temps de biocapteurs FRET de réponse rapide, ces capteurs sont largement utilisés dans les applications environnementales, industrielles et médicales 5. En outre, ratiommesure étrique utilisant biocapteurs FRET a des avantages pratiques importants, car il peut être utilisé pour mesurer des composants dans des échantillons biologiques complexes où la concentration de la sonde ne peut pas être facilement contrôlé et la fluorescence de fond est toujours présent.
En dépit de ces avantages des capteurs à base de FRET pour la visualisation quantitative, de petits changements structurels avec domaine incomplète mouvement de transfert des protéines fluorescentes produisent intrinsèquement faible intensité du signal. Ce signal faible limite l'application des capteurs à base de FRET pour in vitro ou in vivo de l' analyse 6. Par conséquent, la plupart FRET biocapteurs nécessitent l'utilisation d'un matériel coûteux et hautement sensible. Précédemment, nous avons développé un analyseur de FRET peu coûteux et facile à transporter avec des capacités similaires à celles des analyseurs de fluorescence existants 7. Dans ce dispositif, la diode émettrice de lumière ultraviolette bande de 405 nm bon marché (LED) a été utilisé comme source de lumière pour provoquer une excitation de thsignal de fluorescence e, le remplacement d'une lampe ou laser coûteux. Le système de détection de l'analyseur se concentre efficacement le signal de fluorescence de dissipation sur deux photodétecteurs avec une photodiode au silicium. Dans une étude plus récente, nous avons montré que l' optimisation de la température de détection à 50 – 55 ° C pourrait amplifier considérablement le signal de FRET ratiométrique 8. Cette amélioration de signal spécifique à la température, ainsi que le FRET analyseur-mesure, permet l'utilisation de capteurs FRET dans des applications diagnostiques plus générales avec une sensibilité rapide et élevé.
Dans ce protocole, nous avons démontré l'applicabilité générale du dispositif d'analyse de FRET sous des conditions de températures optimales de FRET par la quantification de la teneur en sucre des boissons disponibles dans le commerce. Ce protocole fournit les détails du fonctionnement du dispositif de FRET, ainsi qu'une brève description du capteur et la préparation des échantillons. Nous prévoyons que ce rapport favorisera l'application potentielle du portableanalyseur dans des environnements de laboratoire à petite échelle et de fournir une base pour le développement d'un dispositif peu coûteux sur le site de diagnostic avec des biocapteurs basés sur FRET.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet une quantification rapide et efficace de la teneur en sucre dans les échantillons de boisson, au moyen d' un sur-mesure de FRET analyseur 7 à une température optimale pour les capteurs FRET. L'analyseur a été conçu avec un récemment mis au point, peu coûteux 405 nm bande ultra-violet LED comme source lumineuse et deux photodétecteurs avec une photodiode au silicium. Ce dispositif est plus rentable que les autres fluorimétres comparables. Le dispositif a montré une sensib…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par des subventions du Centre de biologie synthétique intelligente du projet Frontier mondial (2011-0031944) et le Programme Initiative KRIBB recherche.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
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