Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

Summary

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Abstract

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as “Mesangiogenic Progenitor Cells”.

Introduction

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) имеют соответствующую клиническую ценность для их мульти-клонального потенциала дифференциации и их способности поддерживать кроветворение, секретировать факторы роста / цитокины, а также играть определенную роль в иммунорегуляции ^1. В определении MSC на основе производства и применения терапии клетки были объектом обширных клинических и доклинических исследований ^2, с особым вниманием к конкретным международного регулирования для обеспечения безопасности и эффективности лекарственного средства клетки (CBMP) лечения ³ основе. Человеческие MSCs являются широко культивируют в среде, содержащей добавки и реактивы животного происхождения, такие как эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и бычьего трипсина. Поэтому, наряду с инфекционными риски, связанные с манипуляцией клеток, пациенты также сталкиваются с прионные воздействия, а также иммунологические риски, связанные с белками, пептидами или других биомолекул животного происхождения, которые могут сохраняться после сбора клеток и transplanставление ^4.

Чтобы обойти эту проблему, мы культивировали костного мозга человека (HBM) -derived MSCs в животной среде без, заменив FBS с складочный человеческого типа AB в сыворотке крови (PhABS). В этих условиях, наряду с растущими MSCs мы идентифицировали новую популяцию клеток. Эти клетки были морфологически и фенотипически отличаются от ПКЦ и показал характерный профиль экспрессии генов, а также характерные свойства выращиваемый / адгезии. Они сохранили оба mesengenic и развитие кровеносных сосудов , потенциал и , следовательно , были названы Мезодерма клетки – предшественники (ПДК) ^5. Впоследствии, мы смогли определить селективные и воспроизводимые условия культивирования для создания на ПДК высокой степенью чистоты ^6.

Кроме того, мы исследовали морфологические и биологические свойства MPCs. В ПДКп показали быть нестин-положительным, медленно велоспорта, Ki-67-негативных, так и с хромосом характеризуются длинными теломерами ^5. Они выразили PLURipotency-ассоциированные факторы транскрипции Oct-4 и Nanog , а не мастер – регуляторы MSC RUNX2 и Sox9 ^7. Фенотипически ПДКп выразил эндоглина (CD105) на более низком уровне, чем MSCs пока отсутствуют мезенхимальные маркеры CD73, CD90, CD166. ПДКп также показал отличительный молекул адгезии , характеризующихся последовательным выражением РЕСАМ (CD31), интегрины сц (CD11a), аш (CD11b), αX (CD11c), а также интегрином β2 (CD18) , которые специально поддерживает podosome-подобных структур ⁸ , В стандартных средах расширения MSC, ПДКп быстро дифференцировались в ПКЦ через промежуточную стадию с изображением активации Wnt5 / кальмодулин ячейки сигнализации ^9. ПДКп также сохранили ангиогенные свойства, о чем свидетельствует их способность прорастать из сфероидов в мышиных внеклеточного матрикса (ЕСМ) белка 3D культур. Развитие кровеносных сосудов потенциал быстро теряется после MPC дифференциации вдоль mesengenic линии.

Здесь мы представляем протоколы оптимизированы, чтобы изолировать и охарактеризовать высокоочищенные из НВМ ПДК образцов крови. Воспроизводимые протоколы для MPC mesengenic и развитие кровеносных сосудов дифференциации также описаны.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: После письменного согласия образцы НВМ были получены при ортопедической хирургии для замены тазобедренного сустава. Сразу же после того, как бедренной остеотомии шеи и перед бедренных рассверливание 20 мл шприц, содержащий 500 UI гепарина, был использован для аспирата свежий BM. Протокол следует рассматривать широко применимо к любому источнику БМ. 1. Выделение костного мозга человека мононуклеарных клеток (НВМ-МНК) Разведите 5 – 10 мл свежей БМ до 50 мл, применяя фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (D-PBS) и перемешать с помощью инверсии. В равной степени распределить 25 мл в двух новых 50 мл конические пробирки, добавляют 25 мл D-PBS в каждую пробирку и перемешать с помощью инверсии. Дайте пробирки стоять в течение 10 мин при комнатной температуре, для разделения минеральных фрагментов костей и жира из раствора. Осторожно удалите плавающий жир с помощью стерильной пипетки Пастера и фильтра клеточной суспензии через 70 мкм-фильтры, не нарушая фрагмента гранул минеральной костной массы. <Li> Установить четыре 50 мл пробирки с 15 мл среды для прерывистого центрифугирования в градиенте плотности (1,077 г / мл). Убедитесь в том, что эта среда находится при комнатной температуре. Осторожно положите 20 – 25 мл разбавленного БМ на вершине градиента плотности среды. Выполните эту операцию осторожно, позволяя клеточной суспензии струйкой на стенках трубки для предотвращения смешивания слоев. Проводят центрифугирования в градиенте плотности при 400 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре с тормозом отключены. Соберите беловатый кольцо клеток, расположенных между двумя фазами с помощью стерильной пипетки Пастера и передать его в свежую 50 мл пробирку. Промыть клетки свежей культуральной средой: фенолового красного, низкий уровень глюкозы (1000 мг / л) Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) консервированной человеческой типа сыворотки АВ (PhABS), 2 мМ L-глутамина и антибиотики (DMEM / 10% PhABS). Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 5 – 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS. Перейдем к количеству клеток.Определить количество белых кровяных клеток в соотношении 1: 1 разбавление в трипановым. Применить это к гемоцитомер, и наблюдать под фазово-контрастным микроскопом. Исключить маленькие и совершенно округлые эритроциты и синих пятнах мертвые клетки из числа клеток. Примечание: Настоятельно рекомендуется экран PhABS партий для их выполнения в MPC восстановления. PhABS из источников на территории США дали лучшие результаты в то время как большинство сывороток различного происхождения привело к MPC культур с большей долей MSC-подобных клеток. 2. Выделение из MPCs HBM-МНК Установить гидрофобные Т-75 колб с 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и пусть рН и температуры уравновешиваться путем предварительной инкубации при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 30 мин. Семенной 4 – 6 х 10 7 НВМ-МНК на колбу и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в течение 48 часов. Отберите и выбросьте среднего и не прилипшие клетки из колб. Добавьте 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и инкубировать при 37 ° Cв 5% CO 2. Поддержание культуры в течение 6 – 8 дней, изменение среды каждые 48 ч. Необязательно: Чтобы увеличить MPC выход, не прилипшие клетки от 2,3 может быть повторно высевали в новую культуру колбу и поддерживали, как описано для первичных культур. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей DMEM и добавьте 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 5 – 15 мин (во избежание длительной инкубации). Добавляют 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин Отберите и отбросить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 – 2 мл свежей среды DMEM / 10% PhABS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10. ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте трипсин / ЭДТА в качестве отсоединении реагента. ПДКп являются трипсин устойчивостью. Морфологические скрининг культур, до сбора клеток, настоятельно рекомендуется, чтобы оценить наличие веретенообразных MSC-подобных клеток. В случае значительного количества МСК-подобных клеток detected, повысить чистоту продукта клеток путем селективного удаления загрязненных клеток. Для этого, трипсин-переваривание может быть осуществлено до сбора MPC, путем добавления 2 мл трипсина / ЭДТА 0,05% в течение 2 мин. Wash культур дважды с 5 мл DMEM / 10% PhABS, а затем перейти к протеазному обработку, как описано выше. 3. Характеристика Cell Проточной цитометрии Настройка дублирующие образцы 10 5 свеже отдельных клеток в моющем растворе D-PBS , дополненной 0,5% (объем / объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,02% (вес / объем) азида натрия. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным. Повторное приостановить гранул в 200 мкл промывочного раствора и добавить анти-CD90, анти-CD45, анти-CD73 и анти-CD31 антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями ( "Test"); параллельно настроить изотипа управления ( "Ctrl"). Примечание: Суммы окрашивания антител должны быть определены путем титрования или Accorдинь с инструкциями производителя. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 500 мкл промывочного раствора и получают по меньшей мере 5 × 10 4 событий на потоке многоцветной цитометра 7 9 10. Анализ результатов по дот-графиков и использовать "Ctrl" записанные события, чтобы установить квадранта. Примечание: Для того , чтобы определить культуру как MPC культуры процент CD73 нег CD90 нег CD45 + CD31 + клеток должно быть более 95%. Для некоторых конкретных применений, например, анализ экспрессии генов, восстановление отсечка должна быть увеличена до 97 – 98%. Nestin обнаружение и анализ F-актин организация Пластинчатые свежевыделенные ПДКп на культуре камеры горками (20000 / см 2). Разрешить клетки придерживаться путем инкубации в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2. Вымойте клеток в моющем растворе и Ф.И.х в 4% (вес / объем) пара-формальдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. Чтобы удалить закрепляющий добавить моющий раствор, инкубировать в течение 2 мин и разлить. Повторите промывку дважды. Проницаемыми клетки в D-PBS с добавлением 0,05% (об / об) Тритона X-100 в течение 15 мин при комнатной температуре. Остановить реакцию белка свободного энхансер сигнала (30 мин при комнатной температуре) или стандартным блокирующим раствором (D-PBS с добавлением 3% (вес / объем) БСА). Удалить сигнал энхансер / блокирующего раствора. Добавить 7 мкг / мл (вес / об) античеловеческой нестина первичного антитела и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи во влажной камере. Параллельно с этим, использовать изотипные контрольные антитела оценить не специфические сигналы флуоресценции. Вымойте слайдов путем добавления D-PBS, оставьте в течение 2 мин и разлить. Повторите дважды. Добавить 2 мкг / мл (вес / объем) флуоресцентных красителей конъюгированного вторичного антитела и инкубируют при 4 ° С в течение 1 ч в темноте. Вымойте слайды, как указано выше. Добавить флуоресцентный фаллоидином (5 МЕ / мл), оставьте при комнатной температуре в течение 30 мв в темное время суток и промыть 3 раза в D-PBS. Удалите стенки камеры и крепления слайдов в водной среде, дополненной монтажном с antifade реагентом и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для обнаружения ядер. Перейдите к визуализации 7 9 10. 4. Mesengenic Дифференциация MPCs Пластина 2 х 10 4 / см 2 свежевыделенные ПДКп в ТК-обработанных культуральных флаконах Т75 и пусть клетки прилипать в течение ночи в среде DMEM / 10% PhABS при 37 ° С в 5% CO 2. Заменить DMEM / 10% PhABS со стандартным снижением сыворотки среды, около 200 мкл / см 2, предназначенный для расширения мезенхимальных стромальных клеток (MSC-RS среды). Рост клеток до слияния (P1-MSCs), как правило, от 7 до 10 дней от индукции. Обновить средний каждые 2 дня. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей средой MSC-RS и добавляют 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубировать при температуре 3776 ° С в течение 5 – 15 мин (во избежание длительной инкубации). Добавьте 10 мл свежей среды MSC-RS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 – 2 мл свежей среды MSC-RS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10 Перейдите к субкультуре их посевом 3 – 5 х 10 3 клеток / см 2. Рост клеток до слияния (P2-MSCs). Урожай клеток путем протеазы пищеварения, как описано со стадии 4.3 к шагу 4.5 и перейти к характеристике, как описано в разделе 3. Примечание: Процент CD73 + CD90 + CD45 нег CD31 нег клеток ниже 95% будет означать лишь частичную дифференциацию и требуют дальнейшего культивирования проход. Пластина P2-MSCs при 2 х 10 4 / см 2 в шести хорошо TC обработанных пластин и расти до слияния в МСЦ-RS среде. Марк две скважины, как "No Diff" и обновить MSC-RS среды. Марк два хорошоs как "Osteo" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного остеогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации. Марк две скважины , как "ADIPO" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного адипогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации. Поддержание культуры при 37 ° С в 5% СО 2 при условии изменения всей массовой информации каждые 48 ч. Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать стандартные коммерчески доступные дифференцирующие носители для воспроизводимости результатов испытания. Через 2/3 недель условиях дифференцировки, отложения кальция появляются в остеогенных индуцированных культур, в то время как накопление внутриклеточные липидные капли проявляется в адипогенных индуцированных клеток. Отберите и выбросьте питательные среды затем промыть D-PBS. Закрепить культур путем добавления 1 мл 4% (вес / объем) пара-формальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре. Чтобы удалить закрепляющий добавить D-PBS, инкубировать в течение 2 мин и разлить. Повторите промываниедважды. Пятно один "No Diff" вместе с двумя "костно" отмечены скважины в гидроксиапатита конкретного флуоресцентного раствора и один "No Diff" вместе с двумя "Adipo" отмечены скважины в 200 нМ нильский красный раствор. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре 11,12. Удалить окрашивания растворов и мыть в D-PBS дважды. Удалить D-PBS, добавить D-PBS с добавлением 50% (об / об) глицерине и перейти к визуализации 7 9 10. 5. MPC Сфероид Проращивание Анализ Для создания 3D сфероидов, лежали 20 мкл капель свежевыделенными MPC суспензии (1,5 × 10 4 клеток / капли) на внутренней поверхности крышки тарелки Петри. Примечание: В качестве обработки капель может привести к их разрыву, то настоятельно рекомендуется укладывать их в избытке. Осторожно использовать крышку, чтобы резюмировать чашку Петри, содержащую D-PBS, чтобы предотвратить испарение висячей капли. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2ночь, чтобы клетки агрегировать в 3D сфероидов. Установить густой гель мышиных внеклеточного матрикса (ECM) белков путем добавления 300 мкл аликвоты стандартных белков ЕСМ в предварительно охлажденный 24-луночный планшет для культивирования, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Тщательно опрокинуться блюдо крышкой Петри и осторожно подобрать сфероиды с помощью стерильной пипетки Пастера. Lay сфероиды на гель белка ЕСМ, добавляют 700 мкл аликвоты стандартного VEGF-обогащенной среде роста эндотелиальных клеток и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2. Через 24 часа и через 7 дней культивирования, сфотографировать 3D культур при увеличении мощности 4X. Оценка отростков сфероидов, претендующих программного обеспечения для анализа изображений путем измерения радиального расстояния между последней ячейкой и вторгающегося сфероида края. Повторные меры вдоль, по меньшей мере, 20 различных направлений. Среднее расстояние считается положительным, когда 50 мкм или более.

Representative Results

Селективные условия культивирования , описанные здесь , позволили выделение нового прилипший и почти мономорфный клеточной популяции , как 1,0% от НВМ-МНК (0,5 – 2,0 х 10 6 НВМ-МНК от 5 – 10 мл свежих образцов БМ) 5,6 , Мы определили эти большие (40 – 60 мкм в диаметре), округлые, покоящиеся, Ki-67-негативных клеток в качестве MPCs 5. Морфологически они характеризуются отличительным яичницы-образной формы с толстым области сердцевины , окруженной плоской тонкой периферии показывая много филоподий при большем увеличении мощности (белые стрелки на рисунке 1 А.1). Полярный удлинение границы внешней клеточной часто наблюдается (черные стрелки на рисунке 1 А.1). Такая морфология явно отличается от типичного веретенообразной мезенхимального появления стромальных клеток указаны в стандартных культурах MSC. Проточная цитометрия показали более 95% свежеизолированных MPCs выразить CD31 и CD45 а тesenchymal связанные маркеры CD90 и CD73 13 не были обнаружены (рис 1 А.2). Мы рассматриваем этот ограниченный набор из четырех антигенов в качестве ориентировочных для MPCs. Далее отличительные признаки MPCs усеяны распределение F-актин обнажив ряд podosome-подобных структур (красный на рисунке 1 А.3) и интенсивная экспрессия нестина (зеленый на рисунке 1 А.3), который не обнаруживается в клетках окрашивали изотипическим контрольным антителом (данные не показаны). Культивирование ПДКп в стандартных RS среда предназначена для расширения результатов MSC в быстрой дифференциации в экспоненциально растущих MSC-подобных клеток (рисунок 1 B.1). После двух пассажей клетки , наконец , переключить их фенотип от CD73 нег CD90 нег CD45 + CD31 + CD73 + к CD90 + CD45 нег CD31 нег (рис 1 В.2). В процессе, ПДКп повторно органиределить F-актина в стрессовых волокон в то время как нестин экспрессия становится ограничивается редкими клетками (рис 1 В.3). MPC mesengenic дифференциации в определенный MSC-подобный фенотип происходит через две различные стадии, выявленные различными морфологией клеток. После одной недели в среде MSC RS остаточная популяция MPC-подобных клеток по – прежнему обнаруживается в пределах вырожденного слоя плоских, полигональных многозабойных клеток (P1-MSCs на рисунке 2 А). Дальнейшее прохождение требуется получить почти мономорфический культуру веретенообразных MSC-подобные клетки (P2-MSCs на рисунке 2 А). Эти экспоненциально растущие клетки могут легко дифференцироваться в остеобласты или адипоцитов при передаче в селективной среде в течение по крайней мере 2-х недель, таким образом подтверждая их MSC характер. В остеогенных индуцированных культур, отложения кальция могут быть обнаружены с помощью либо колориметрическим ализарин-S окрашивать или специфических флуоресцентных красителей (зеленый на рисунке 2 , B). После того, как адипогенных индукционных клетокпоказывают накопление липидов капель , как показали либо колориметрическим Oil Red или флуоресцентный Нила Красное пятно (красный на рисунке 2 B). МРС типирование было подтверждено прорастание ангиогенеза анализа. ПДКп показали свою способность вторгнуться (более 50 мкм) гель белка мышиного ECM от 3D сфероидов после 24 ч VEGF-раздражитель (рис 2 C). Через неделю вторгшиеся клетки были обнаружены при 300 – 600 мкм на расстоянии. С другой стороны , емкость вторжение было потеряно в Р2-ПКЦ после mesengenic дифференцировки (рис 2 D). Рисунок 1. свежеизолированных ПДКп имеют отличительные особенности. Культивирование HBM-МНК в DMEM / 10% PhABS в течение семи дней приводит к популяции покоящихся MPCs (А) легко отличить от ПКЦ (B) </stronг> с точки зрения морфологии (A.1, B.1, масштабные линейки = 100 мкм), фенотип (А.2, В.2), F-актин распределения (красный в А.3, Б.3), и нестин выражение (зеленый в А.3, В.3, масштабные линейки = 20 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. ПДКп дифференцироваться в стандартных MSCs и Show ангиогенеза побегов пробирке. Замена DMEM / PhABS с коммерчески доступными RS средой , предназначенных для расширения MSC запускает mesengenic индукции MPCs. Через одну неделю в культуре мало остаточных ПДКп все еще ​​наблюдается (Р1-МСК) в то время как дальнейшее прохождение в ЦКМ-RS среде приводит к популяции сливающихся ЦКМ-подобных клеток (Р2-ПКЦ, шкале полоски = 100 мкм). п2-терминально MSCs дифференцироваться в остеоциты или адипоцитов при надлежащих стимулов , как показали отложение кальция (зеленый в B) и накоплением липидов капельным (красный в B, окалины полоски = 200 мкм), соответственно. ПДКп показывают последовательное отростков сфероидов в мышиной ECM белка геля (С) при разнице с P2-ПКЦ (D, масштаб баров = 1,0 мм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders^14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity¹⁶, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation.

Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability^17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity^10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in “crude” and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)². Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.

A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation²¹. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs^5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum⁶. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.

MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported⁹ would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions.

It is not clear if these “contaminating” MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow²² or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.

Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation⁷. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described^5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as “Mesangiogenic Progenitor Cells”, maintaining the acronym MPCs.

We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages²³.

Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

Materials

Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9-12 mg/ml) Final Concentration: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μm Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Sweden)	17-5442-03	medium for discontinuos density gradient centrifugation
Pooled human AB type serum (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Final Concentration: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100X Final Concentration: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5%
Sodium Azide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Final Concentration: 0.02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/mL penicillin, 5,000 ug/mL Streptomycin Final Concentration: 50 UI/mL penicillin, 50 ug/mL Streptomycin
T-75 culture flask for suspension cultures	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658 190
T-75 culture flask TC treated	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Animal- free proteases detaching solution Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25%
anti-CD90 APC antibody  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-402	Final Concentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-609	Final Concentration: 1:40
anti-CD73 PE antibody (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-182	Final Concentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-105-260	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 APC antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-846	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-637	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-845	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-563	Final Concentration: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1'000 mg/l glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stock Concentration:0.2 mg/mL Final Concentration: 2 μg/mL
Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1X
Paraformaldehyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixative Final Concentration: 4%
LAB-TEK two-well chamber slides	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anti-Nestin antibody [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italy)	EMR237500	Final Concentration: '0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml
Pasteur Pipette	Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-678
Osteoimage Bone mineralization Assay	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution
50mL Polystyrene conical tube	Greiner bio-one (Kremsmünster Austria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm
Glycerin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Final Concentration: '50%
Polistirene Petri dishes	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
24-well plates TC-treated	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)	662160
Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)	LONZA (Walkersville MD-USA)	CC-3162	VEGF-rich endothelial cell growth medium
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Germany)		Image analysis software