मानव अस्थि मज्जा से अलग Mesangiogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (MPCs)

Summary

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Abstract

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as “Mesangiogenic Progenitor Cells”.

Introduction

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) उनकी बहु-वंश भेदभाव क्षमता और उनके विकास के कारकों / साइटोकिन्स स्रावित करने के साथ ही immunoregulation ¹ में एक भूमिका निभाने के लिए क्षमता hemopoiesis का समर्थन करने के लिए प्रासंगिक नैदानिक ​​मूल्य के हैं। एमएससी आधारित चिकित्सा सेल के उत्पादन और आवेदन की परिभाषा में सुरक्षा और सेल की प्रभावकारिता औषधीय उत्पाद (CBMP) उपचार के ³ आधार के लिए विशिष्ट अंतरराष्ट्रीय विनियमन करने के लिए विशेष ध्यान के साथ व्यापक नैदानिक ​​और पूर्व नैदानिक ​​अनुसंधान ² की वस्तु किया गया है। मानव MSCs ऐसे भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और गोजातीय trypsin के रूप में की आपूर्ति करता है और जानवर मूल के अभिकर्मकों युक्त मीडिया में बड़े पैमाने पर सुसंस्कृत हैं। इसलिए, के साथ साथ सेल हेरफेर के साथ जुड़े जोखिम संक्रामक, रोगियों को भी प्रिओन जोखिम के रूप में अच्छी तरह से प्रतिरक्षा प्रोटीन, पेप्टाइड या जानवर मूल के अन्य जैविक अणुओं से जुड़े जोखिम का सामना सेल कटाई और transplan के बाद जारी रहती सकता है किtation ^4।

समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम मानव अस्थि मज्जा (HBM) पशु मुक्त माध्यम में व्युत्पन्न MSCs सुसंस्कृत, जमा मानव अटल बिहारी प्रकार सीरम (PhABS) के साथ FBS की जगह ले। इन शर्तों के तहत, बढ़ती MSCs के साथ-साथ हम एक उपन्यास सेल की आबादी की पहचान की। इन कोशिकाओं को आकृति विज्ञान और phenotypically MSCs से अलग थे और एक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के साथ ही विशेषता से बढ़ / आसंजन गुण दिखाया। वे अपने पास रखा दोनों mesengenic और एन्जियोजेनिक क्षमता और इसलिए नाम थे mesodermal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (MPCs) ^5। बाद में, हम पवित्रता ⁶ के उच्च ग्रेड पर MPCs उत्पन्न करने के लिए चयनात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संस्कृति की स्थिति को परिभाषित करने में सक्षम थे।

हम आगे MPCs की रूपात्मक और जैविक गुणों की जांच की। MPCs nestin पॉजिटिव, साइकिल चालन में धीमी गति से होने से पता चला है, की-67-नकारात्मक है, और लंबे टेलोमेयर ⁵ की विशेषता गुणसूत्रों के साथ। वे Plur व्यक्तipotency जुड़े प्रतिलेखन कारक Oct-4 और Nanog बजाय एमएससी मास्टर नियामकों Runx2 और Sox9 ^7। Phenotypically, MPCs जबकि mesenchymal मार्कर CD73, CD90, CD166 कमी MSCs की तुलना में निचले स्तर पर endoglin (CD105) व्यक्त किया। MPCs भी PECAM (CD31) के अनुरूप अभिव्यक्ति की विशेषता आसंजन अणुओं, इंटेग्रिन αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) के साथ ही इंटीग्रिन β2 (CD18) के एक विशिष्ट पैटर्न है कि विशेष रूप से बनाए podosome संरचनाओं की तरह ⁸ से पता चला । मानक एमएससी विस्तार मीडिया में, MPCs तुरंत Wnt5 / Calmodulin सेल ⁹ संकेत के सक्रियण की विशेषता एक मध्यवर्ती चरण के माध्यम से MSCs में विभेदित। MPCs के रूप में भी murine बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन 3 डी संस्कृतियों में spheroids से अंकुरित करने के लिए अपनी क्षमता से प्रदर्शन किया, एन्जियोजेनिक गुण को बनाए रखा। एन्जियोजेनिक संभावित तेजी से mesengenic वंश साथ एमपीसी भेदभाव के बाद खो गया था।

यहाँ हम समर्थक उपस्थितtocols अलग-थलग करने और HBM रक्त के नमूनों से उच्च शुद्ध MPCs को चिह्नित करने के लिए अनुकूलित। एमपीसी mesengenic और एन्जियोजेनिक भेदभाव के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं।

Protocol

नोट: लिखित सहमति के बाद, HBM नमूने हिप रिप्लेसमेंट के लिए आर्थोपेडिक सर्जरी के दौरान प्राप्त किया गया। इसके तत्काल बाद ऊरु गर्दन osteotomy के बाद और ऊरु से पहले एक 20 मिलीलीटर हेपरिन के 500 यूआई युक्त सिरिंज reaming, ताजा बी.एम. aspirate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रोटोकॉल व्यापक रूप से किसी भी बी.एम. स्रोत के लिए लागू माना जा रहा है। 1. मानव अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear के अलगाव (HBM-एमएनसी) 50 मिलीलीटर ताजा बी.एम. के 10 मिलीलीटर, Dulbecco फॉस्फेट बफर नमकीन घोल (डी पीबीएस) लागू करने और उलटा द्वारा मिश्रण – 5 पतला। समान रूप से, दो नए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 25 मिलीलीटर वितरित प्रत्येक ट्यूब डी पीबीएस के 25 मिलीलीटर जोड़ने और उलटा द्वारा मिश्रण। ट्यूब, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े करने के लिए समाधान से खनिज हड्डी के टुकड़े की जुदाई और वसा के लिए अनुमति दें। ध्यान से खनिज हड्डी टुकड़ा गोली परेशान बिना 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक बाँझ पाश्चर विंदुक और फिल्टर सेल निलंबन के साथ चल वसा को हटा दें। <li> असंतत घनत्व ढाल centrifugation के लिए माध्यम के 15 मिलीलीटर (1.077 g / एमएल) के साथ चार 50 मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें। सुनिश्चित करें कि इस माध्यम कमरे के तापमान पर है सुनिश्चित करें। घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर पतला बी.एम. के 25 मिलीलीटर – धीरे 20 लेट गई। ट्यूब दीवारों पर सेल निलंबन मिलने दे मिश्रण परतों को रोकने के लिए ध्यान से यह कार्रवाई। अक्षम ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर घनत्व ढाल centrifugation बाहर ले। एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग दो चरणों के बीच स्थित कोशिकाओं के श्वेताभ अंगूठी ले लीजिए और एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण। ताजा संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं को धो लें: फिनोल लाल मुक्त, कम ग्लूकोज (1000 मिलीग्राम / एल) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% (वी / वी) जमा मानव अटल बिहारी प्रकार सीरम (PhABS), 2 मिमी एल glutamine और एंटीबायोटिक दवाओं (DMEM / 10% PhABS)। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और फिर से निलंबित 5 में गोली – 10 ताजा DMEM के मिलीलीटर / 10% PhABS। कोशिका गिनती करने के लिए आगे बढ़ें।trypan में 1 कमजोर पड़ने: 1 द्वारा श्वेत रक्त कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। hemocytometer के लिए यह लागू है, और एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं। कोशिकाओं की संख्या से छोटे और पूरी तरह से गोल एरिथ्रोसाइट्स और नीले रंग से सना हुआ मृत कोशिकाओं को बाहर। नोट: यह अत्यधिक एमपीसी वसूली में उनके प्रदर्शन के लिए स्क्रीन PhABS बैचों की सिफारिश की है। संयुक्त राज्य अमेरिका स्रोतों से PhABS सबसे अच्छा परिणाम दे दिया है, जबकि विभिन्न मूल के सबसे सीरा एमएससी की तरह कोशिकाओं के साथ उच्च प्रतिशत एमपीसी संस्कृतियों में हुई। HBM-बहुराष्ट्रीय कंपनियों से MPCs के 2. अलगाव ताजा DMEM / 10% PhABS के 15 मिलीलीटर के साथ हाइड्रोफोबिक टी 75 बोतल सेट और पीएच और तापमान 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ऊष्मायन से संतुलित करते हैं। बीज 4 – 6 10 x 7 कुप्पी प्रति HBM-बहुराष्ट्रीय कंपनियों और 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। महाप्राण और बोतल से मध्यम और गैर पक्षपाती कोशिकाओं त्यागें। ताजा DMEM / 10% PhABS के 15 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते5% सीओ 2। 6 के लिए संस्कृतियों को बनाए रखने – 8 दिन, हर 48 घंटे के बदलते माध्यम। वैकल्पिक: एमपीसी उपज बढ़ाने के लिए, 2.3 से गैर पक्षपाती कोशिकाओं को एक नई संस्कृति फ्लास्क में फिर से चढ़ाया और के रूप में प्राथमिक संस्कृतियों के लिए वर्णित बनाए रखा जा सकता है। महाप्राण और बोतल से मध्यम त्यागें, ताजा DMEM से धो लें और पशु मुक्त प्रोटीज समाधान detaching के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 15 मिनट (लंबे समय तक ऊष्मायन बचने के लिए) – 5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 5 मिनट के लिए 400 XG पर ताजा DMEM / 10% PhABS के 10 मिलीलीटर जोड़ें aspirate सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 में फिर से निलंबित गोली – ताजा DMEM के 2 मिलीलीटर / 10% PhABS। कदम 1.10 में वर्णित के रूप में सेल गिनती करने के लिए आगे बढ़ें। नोट: अभिकर्मक detaching के रूप में trypsin / EDTA का प्रयोग न करें। MPCs प्रतिरोधी trypsin रहे हैं। संस्कृतियों के रूपात्मक स्क्रीनिंग, सेल कटाई से पहले, अत्यधिक आदेश धुरी के आकार एमएससी की तरह कोशिकाओं की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है। एमएससी कोशिकाओं की तरह के मामले काफी राशि में D रहे हैंetected, चुनिंदा दूषित कोशिकाओं को हटाने के द्वारा सेल उत्पाद की शुद्धता को बढ़ाने के। ऐसा करने के लिए, trypsin पाचन बाहर से पहले एमपीसी कटाई करने के लिए, किया जा सकता है 2 मिनट के लिए trypsin के 2 मिलीलीटर / EDTA 0.05% जोड़कर। धो संस्कृतियों दो बार DMEM / 10% PhABS के 5 मिलीलीटर के साथ है, तो ऊपर के रूप में उपचार प्रोटीज लिए आगे बढ़ें। 3. सेल विशेषता फ़्लो साइटॉमेट्री समाधान धोने में 10 5 हौसले से अलग कोशिकाओं के नमूने नकली सेट करें: डी-पीबीएस 0.5% (वी / वी) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.02% (w / v) सोडियम azide के साथ पूरक। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। चेतावनी: सोडियम azide विषैला होता है। पुनः निलंबित समाधान धोने के 200 μl में छर्रों और विरोधी CD90, विरोधी CD45, विरोधी CD73 और फ्लोरोसेंट रंजक ( "टेस्ट") के साथ संयुग्मित विरोधी CD31 एंटीबॉडी जोड़ने; समानांतर में निर्धारण नियंत्रण ( "Ctrl") की स्थापना की। नोट: एंटीबॉडी धुंधला की राशियाँ अनुमापन या एक्कोर द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिएडिंग निर्माता के निर्देशों के। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। समाधान धोने के 500 μl में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और कोशिकामापी 7 9 10 बहुरंगा प्रवाह पर कम से कम 5 एक्स 10 4 घटनाओं के अधिग्रहण। डॉट भूखंडों द्वारा परिणामों का विश्लेषण और quadrants स्थापित करने के लिए "Ctrl" दर्ज की घटनाओं का उपयोग करें। नोट: आदेश एमपीसी संस्कृति के रूप में संस्कृति को परिभाषित करने के लिए CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + कोशिकाओं का प्रतिशत 95% से अधिक होना चाहिए। 98% – कुछ विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए, यानी, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, वसूली कट ऑफ 97 तक बढ़ाया जाना है। Nestin का पता लगाने और एफ actin संगठन विश्लेषण संस्कृति कक्ष स्लाइड पर प्लेट हौसले से पृथक MPCs (20,000 / 2 सेमी)। कोशिकाओं 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात ऊष्मायन से पालन करने की अनुमति दें। समाधान और फाई धोने में कोशिकाओं को धो लें4% x 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर (w / v) पैरा-formaldehyde। लगानेवाला, कपड़े धोने समाधान जोड़ने के 2 मिनट के लिए सेते हैं और डालना निकालने के लिए। कपड़े धोने दो बार दोहराएँ। डी-पीबीएस में permeabilize कोशिकाओं आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.05% (वी / वी) ट्राइटन X-100 के साथ पूरक। प्रोटीन मुक्त संकेत बढ़ाने (आरटी पर 30 मिनट) या मानक अवरुद्ध समाधान द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो (डी पीबीएस 3% के साथ पूरक (w / v) बीएसए)। हटाये संकेत बढ़ाने / अवरुद्ध समाधान। 7 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ें विरोधी मानव nestin प्राथमिक एंटीबॉडी के (v / डब्ल्यू) और एक humidified कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। समानांतर में, नहीं विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेतों का मूल्यांकन करने के isotypic नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग करें। डी-पीबीएस जोड़कर स्लाइड्स धो लें, 2 मिनट के लिए छोड़ दें और डाल देना। दो बार दोहराएँ। 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ें फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के (v / डब्ल्यू) और अंधेरे में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। धो ऊपर के रूप में स्लाइड। फ्लोरोसेंट Phalloidin (5 यूआई / एमएल) जोड़ें, 30 मीटर के लिए आरटी पर छोड़और अंधेरे में डी-पीबीएस में 3 बार धोएं। कक्ष की दीवारों निकालें और जलीय बढ़ते मध्यम नाभिक का पता लगाने के लिए antifade अभिकर्मक और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ पूरक में स्लाइड माउंट। इमेजिंग के लिए 7 9 10 से आगे बढ़ें। 4. MPCs की Mesengenic भेदभाव प्लेट 2 एक्स 10 4/2 सेमी टीसी इलाज T75 संस्कृति बोतल में हौसले से पृथक MPCs और कोशिकाओं 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM / 10% PhABS में रात भर का पालन करते हैं। मानक कम सीरम माध्यम है, के बारे में 200 μl / 2 सेमी, mesenchymal stromal सेल विस्तार (एमएससी-आरएस मध्यम) के लिए डिजाइन के साथ DMEM / 10% PhABS बदलें। प्रेरण से 7 से 10 दिनों से संगम के लिए (P1-MSCs), आम तौर पर कोशिकाओं को विकसित। मध्यम रिफ्रेश करें हर 2 दिन। महाप्राण और बोतल से मध्यम त्यागें, ताजा एमएससी रुपये मध्यम से धो लें और पशु मुक्त प्रोटीज समाधान detaching के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 37 पर सेते76, 5 के लिए सी – 15 मिनट (लंबे समय तक ऊष्मायन बचने के लिए)। 5 मिनट के लिए 400 XG पर ताजा एमएससी रुपये माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें aspirate सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और फिर से निलंबित 1 में गोली – 2 ताजा एमएससी रुपये माध्यम की मिलीलीटर। कदम 1.10 में वर्णित के रूप में सेल गिनती करने के लिए आगे बढ़ें 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी – बोने 3 से उन्हें उप-संस्कृति के लिए आगे बढ़ें। संगम के लिए (p2-MSCs) कोशिकाओं को विकसित। प्रोटीज पाचन द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं 4.5 कदम और धारा 3 में वर्णित के रूप में लक्षण वर्णन करने के लिए आगे बढ़ने के लिए कदम 4.3 से वर्णित है। नोट: CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg कोशिकाओं का एक प्रतिशत से कम 95% केवल आंशिक भेदभाव से संकेत मिलता है और एक और संस्कृति पारित होने की आवश्यकता होगी। प्लेट P2-MSCs 2 एक्स 10 4/2 सेमी छह अच्छी तरह से टीसी इलाज प्लेटों में और बढ़ने में एमएससी-आरएस माध्यम में संगम के लिए। मार्क के रूप में "नहीं डिफ" दो कुओं और ताज़ा एमएससी रुपये माध्यम। मार्क दो अच्छी तरह से"Osteo" और 200 μl / मानक osteogenic के माध्यम से 2 सेमी, विशेष रूप से एमएससी भेदभाव के लिए डिजाइन के साथ मध्यम जगह के रूप में। मार्क के रूप में "Adipo" दो कुओं और 200 μl / मानक adipogenic के माध्यम से 2 सेमी, विशेष रूप से एमएससी भेदभाव के लिए डिजाइन के साथ मध्यम जगह। पूरे मीडिया हर 48 घंटा बदलकर 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बनाए रखें। नोट: यह अत्यधिक परीक्षण reproducibility के लिए मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फर्क मीडिया का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। फर्क की शर्तों के तहत 2/3 सप्ताह के बाद, कैल्शियम जमा, osteogenic प्रेरित संस्कृतियों में दिखाई देते हैं, जबकि intracellular लिपिड बूंदों संचय adipogenic प्रेरित कोशिकाओं में स्पष्ट है। महाप्राण त्यागने और संस्कृति मीडिया तो डी-पीबीएस से धो लें। (डब्ल्यू / वी) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पैरा-formaldehyde 4% की 1 मिलीलीटर जोड़कर संस्कृतियों को ठीक करें। लगानेवाला डी-पीबीएस जोड़ने, 2 मिनट के लिए सेते हैं और डालना निकालने के लिए। दोहराएँ धोनेदो बार। दाग एक "नहीं डिफ" के साथ एक साथ दो "Osteo" एक साथ चिह्नित हाइड्रॉक्सियापटाइट विशिष्ट फ्लोरोसेंट समाधान और एक "नहीं डिफ" में कुओं के साथ दो "Adipo" 200 एनएम नील लाल समाधान में कुओं में चिह्नित। कमरे के तापमान 11,12 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। समाधान निकालें और धुंधला हो जाना दो बार डी पीबीएस में धो लें। डी-पीबीएस निकालें, जोड़-डी पीबीएस के साथ 50% (वी / वी) ग्लिसरीन पूरक और इमेजिंग 7 9 10 पर आगे बढ़ें। 5. एमपीसी उपगोल अंकुरित परख 3 डी spheroids का उत्पादन करने के लिए, एक पेट्री डिश ढक्कन की भीतरी सतह पर हौसले से पृथक एमपीसी निलंबन (1.5 x 10 4 कोशिकाओं / ड्रॉप) के 20 μl बूँदें लेट गई। नोट: हैंडलिंग बूँदें उनकी टूटना करने के लिए ले जा सकता है के रूप में, यह अत्यधिक उन्हें अधिक में रखना करने के लिए recommendable है। ध्यान से डी-पीबीएस फांसी वाष्पीकरण बूंदों को रोकने के लिए युक्त एक पेट्री डिश संक्षिप्त करने के लिए ढक्कन का उपयोग करें। 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते सीओ 2रातोंरात कोशिकाओं 3 डी spheroids में कुल करने के लिए अनुमति देने के लिए। एक पूर्व प्रशीतित 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में मानक ईसीएम प्रोटीन के 300 μl aliquots जोड़कर murine बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन की एक मोटी जेल सेट, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ध्यान से पेट्री डिश ढक्कन नोक पर और धीरे से एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग spheroids उठाओ। ईसीएम प्रोटीन जेल पर spheroids निर्धारित करना, मानक वीईजीएफ़ अमीर endothelial सेल मध्यम विकास के 700 μl aliquots जोड़ें और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 24 घंटे के बाद और संस्कृति के 7 दिन पर, 4x बढ़ाई बिजली पर 3 डी संस्कृतियों की तस्वीरें ले लो। पिछले हमलावर सेल और अंडाकार आकृति किनारे के बीच रेडियल दूरी को मापने के द्वारा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को लागू करने spheroids से अंकुरण का मूल्यांकन। कम से कम 20 अलग अलग दिशाओं के साथ दोहराएँ उपाय। मतलब दूरी जब 50 माइक्रोन या अधिक सकारात्मक रूप में माना जाता है।

Representative Results

चयनात्मक संस्कृति यहाँ वर्णित शर्तों HBM-बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 1.0% के रूप में एक उपन्यास पक्षपाती और लगभग monomorphic सेल की आबादी के अलगाव की अनुमति दी है (0.5 – 2.0 x 10 5 से 6 HBM-बहुराष्ट्रीय कंपनियों – ताजा बी.एम. नमूनों की 10 मिलीलीटर) 5,6 । हम इन बड़े (40 – व्यास में 60 माइक्रोन) की पहचान की, MPCs के रूप में 5 गोल, मौन, की-67-नकारात्मक कोशिकाओं। आकृति विज्ञान, वे (चित्रा 1 ए .1 में सफेद तीर) उच्च बढ़ाई सत्ता में filopodia के बहुत सारे दिखा एक फ्लैट पतली परिधि से घिरा हुआ एक मोटी कोर क्षेत्र के साथ एक विशिष्ट तला हुआ अंडा आकार की विशेषता है। बाहरी सेल सीमा के ध्रुवीय बढ़ाव अक्सर (चित्रा 1 ए .1 में काला तीर) मनाया जाता है। इस तरह की आकृति विज्ञान मानक एमएससी संस्कृतियों में सूचना दी ठेठ धुरी के आकार mesenchymal stromal सेल उपस्थिति से स्पष्ट रूप से अलग है। फ्लो का CD31 और CD45 जबकि एम व्यक्त करने के लिए हौसले से पृथक MPCs के 95% से अधिक से पता चलाesenchymal जुड़े मार्कर CD90 और CD73 13 undetectable (चित्रा 1 .2) थे। हम MPCs के लिए के रूप में सांकेतिक चार एंटीजन के इस प्रतिबंधित सेट में मानते हैं। MPCs के आगे विशिष्ठ सुविधाओं (चित्रा 1 A.3 में लाल) podosome संरचनाओं की तरह का एक नंबर का खुलासा बिंदीदार एफ actin वितरण और nestin की तीव्र अभिव्यक्ति (चित्रा 1 A.3 में हरा) है, जो कोशिकाओं में पाया नहीं है isotypic नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग (डेटा) नहीं दिखाया। मानक रुपये में संवर्धन MPCs मध्यम तेजी से बढ़ रही एमएससी की तरह कोशिकाओं (चित्रा 1 B.1) में तेजी से भेदभाव में एमएससी विस्तार परिणामों के लिए बनाया गया है। दो मार्ग के बाद कोशिकाओं अंत में CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (चित्रा 1 B.2) से CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + उनकी phenotype स्विच। इस प्रक्रिया में, MPCs फिर से संगठनोंतनाव तंतुओं में Nize एफ actin जबकि nestin अभिव्यक्ति कुछ दुर्लभ कोशिकाओं (चित्रा 1 B.3) तक ही सीमित हो जाता है। एमपीसी एक निश्चित एमएससी की तरह phenotype में mesengenic भेदभाव दो अलग अलग सेल morphologies से पता चला कदम के माध्यम से होता है। एमएससी रुपये माध्यम में एक सप्ताह के एमपीसी की तरह कोशिकाओं की एक अवशिष्ट आबादी होने के बाद अभी भी (चित्रा 2 ए में P1-MSCs) फ्लैट, बहुभुज बहु शाखाओं कोशिकाओं की एक परत के भीतर मिला हुआ detectable है। एक और बीतने (चित्रा 2 एक में p2-MSCs) धुरी के आकार एमएससी कोशिकाओं की तरह के एक लगभग monomorphic संस्कृति प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। ये तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं को आसानी से जब कम से कम 2 सप्ताह के लिए चयनात्मक मीडिया में स्थानांतरित किया है, इस प्रकार अपनी एमएससी प्रकृति की पुष्टि अस्थिकोरक या adipocytes में अंतर कर सकते। Osteogenic प्रेरित संस्कृतियों में, कैल्शियम जमा या तो वर्णमिति Alizarin-एस दाग या विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों में (चित्रा 2 बी) हरे से पता लगाया जा सकता है। adipogenic प्रेरण कोशिकाओं के बादके रूप में (चित्रा 2 बी लाल) या तो वर्णमिति तेल लाल या फ्लोरोसेंट नील लाल दाग से पता चला लिपिड छोटी बूंद संचय दिखा। एमपीसी टाइपिंग angiogenesis परख अंकुरण द्वारा पुष्टि की गई। MPCs के बाद 24 घंटे वीईजीएफ़ प्रोत्साहन (चित्रा 2 सी) 3 डी spheroids से (50 माइक्रोन से अधिक) पर आक्रमण करने के murine ईसीएम प्रोटीन जेल अपनी क्षमता से पता चला है। 600 माइक्रोन दूरी – के बाद एक सप्ताह हमलावर कोशिकाओं 300 पर पाया गया। इसके विपरीत, आक्रमण क्षमता mesengenic भेदभाव (चित्रा 2 डी) के बाद P2-MSCs में खो गया था। चित्रा 1. हौसले से पृथक MPCs सात दिनों के लिए विशिष्ट सुविधाओं है। DMEM / 10% PhABS में संवर्धन HBM-बहुराष्ट्रीय कंपनियों मौन MPCs (ए) MSCs से आसानी से अलग पहचाना की आबादी (बी) को जन्म देता है </stronजी> आकृति विज्ञान की दृष्टि से (A.1, B.1, स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन), phenotype (A.2, B.2), एफ actin वितरण (A.3 में लाल, B.3), और nestin अभिव्यक्ति (A.3, B.3 में हरे, स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2. MPCs स्टैंडर्ड MSCs और मध्यम एमएससी विस्तार के लिए डिज़ाइन किया गया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रुपये के साथ DMEM / PhABS के इन विट्रो। रिप्लेसमेंट में दिखाएँ अंकुरित एंजियोजिनेसिस में अंतर MPCs की mesengenic प्रेरण से चलाता है। संस्कृति में एक सप्ताह के बाद कुछ अवशिष्ट MPCs अभी भी detectable (P1-MSCs), जबकि एमएससी रुपये माध्यम में एक आगे बीतने मिला हुआ एमएससी की तरह कोशिकाओं की आबादी (p2-MSCs, एक पैमाने सलाखों = 100 माइक्रोन) की ओर जाता है। पी2-MSCs टर्मिनली उचित उत्तेजनाओं के तहत osteocytes या adipocytes में के रूप में कैल्शियम बयान (बी में हरा) और लिपिड छोटी बूंद संचय (बी में लाल, स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन) द्वारा पता चला क्रमशः अंतर। MPCs P2-MSCs (डी, स्केल सलाखों = 1.0 मिमी) के साथ एक अंतर पर murine ईसीएम प्रोटीन जेल (सी) में spheroids से लगातार अंकुरण दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders^14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity¹⁶, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation.

Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability^17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity^10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in “crude” and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)². Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.

A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation²¹. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs^5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum⁶. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.

MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported⁹ would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions.

It is not clear if these “contaminating” MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow²² or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.

Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation⁷. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described^5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as “Mesangiogenic Progenitor Cells”, maintaining the acronym MPCs.

We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages²³.

Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

Materials

Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9-12 mg/ml) Final Concentration: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μm Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Sweden)	17-5442-03	medium for discontinuos density gradient centrifugation
Pooled human AB type serum (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Final Concentration: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100X Final Concentration: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5%
Sodium Azide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Final Concentration: 0.02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/mL penicillin, 5,000 ug/mL Streptomycin Final Concentration: 50 UI/mL penicillin, 50 ug/mL Streptomycin
T-75 culture flask for suspension cultures	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658 190
T-75 culture flask TC treated	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Animal- free proteases detaching solution Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25%
anti-CD90 APC antibody  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-402	Final Concentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-609	Final Concentration: 1:40
anti-CD73 PE antibody (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-182	Final Concentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-105-260	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 APC antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-846	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-637	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-845	Final Concentration: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-563	Final Concentration: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1'000 mg/l glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stock Concentration:0.2 mg/mL Final Concentration: 2 μg/mL
Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1X
Paraformaldehyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixative Final Concentration: 4%
LAB-TEK two-well chamber slides	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anti-Nestin antibody [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italy)	EMR237500	Final Concentration: '0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml
Pasteur Pipette	Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-678
Osteoimage Bone mineralization Assay	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution
50mL Polystyrene conical tube	Greiner bio-one (Kremsmünster Austria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm
Glycerin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Final Concentration: '50%
Polistirene Petri dishes	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
24-well plates TC-treated	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)	662160
Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)	LONZA (Walkersville MD-USA)	CC-3162	VEGF-rich endothelial cell growth medium
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Germany)		Image analysis software