에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술
Summary
적응 진화와 분리 기술을 설명하고 신속하게 육탄 당과 효소의 오탄당의 혼합 당이 undetoxified 가수 분해물을 당화 및 40g / L의 에탄올을 통해 축적 소비 할 수있는 Scheffersomyces stipitis 변형의 파생 상품 NRRL Y-7124을 얻었다 증명된다.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 추정 연간 13 억 건조 톤의 에탄올 생산을 지원하고 미국은 30 %의 석유 소비를 줄일 수 있습니다. 1 포도당과 자일 로스 풍부한 식물 바이오 매스 가수 분해 수율 설탕 혼합물, 발효 억제제가 필요한 화학적 전처리에 의해 생성되지만 헤미 셀룰로스를 분해 및 효소 공격 셀룰로오스를 노출합니다. 아세트산, 푸르 푸랄, 및 (HMF) hydroxymethylfurfural는 전처리 중에 형성 많은 억제제 중 주요 구성 요소로 생각된다. 전방 목질 에탄올 산업을 이동하기 위해 연구 절차 생존 효율적 필요한 같은 억제 화합물의 존재하에 육탄 당 및 오탄당 당 모두를 사용하는 기능 할 효모의 진화를 허용한다. 이러한 사카 cerevisiae의 전통 산업 효모 균주의 중요한 추가 약점은, 효율적으로 fermen 할 수 없다는 것입니다식물 바이오 매스의 가수 분해물에서 사용할 수있는 자일 로스에서 t.
피 키아 stipitis 형 균주 NRRL Y-7124 (5773 CBS)는 최근 이름을 바꾼 Scheffersomyces의 stipitis는 잘 에탄올에 자일 로스를 발효하는 것으로 알려져 기본 펜 토스 발효 효모이다. 2,3 여기 추진 된 균주 NRRL Y-7124의 진화가에 문서화되어 있기 때문에 작은 자일리톨 부산물로 40g / L을 초과하는 경제적 복구 에탄올을 축적하는 기본 효모 균주의 가장 큰 잠재력을 가지고있다. 4,5,6을 최적의 미디어, S.에서 stipitis 균주 NRRL Y-7124은 0.41 ± 0.06 g / g 높은 세포 밀도 문화 (6 g / L 세포)이다. 7, 8 저항의 수율 40 시간 (1.75 g / L / 시간) 70 g /의 L의 에탄올을 생산 발효 억제제 에탄올, 푸르 푸랄 및 HMF에도 9 및 S.,보고 된 stipitis은 상업적 규모의 에탄올 블라우스 가능한 가장 유망한 기본 펜 토스 발효 효모 중에서 선정되었습니다N 리그 노 셀룰로즈에서. (10) 우리의 목표는 산업용 애플리케이션에 적합한 균주 NRRL Y-7124의보다 강력한 파생 상품으로 진화를 강제로 다양한 undetoxified 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물과 에탄올의 선택 압력을 적용하는 것이 었습니다. 추구 향상된 기능 중 핵심은 농축 된 가수 분해물의 빠른 설탕 흡수 속도,보다 효율적으로 혼합 된 설탕 이용을위한 감소 diauxy, 에탄올 및 억제제의 높은 허용 오차했다. S.의 응용 프로그램 undetoxified 가수 분해물에 stipitis는 overliming 같은 가수 해독 프로세스와 연관된 추가 운영비를 제거하기 위해 연구의 핵심이 있었다.
두 산업 유망 가수 분해물은 진화를 강제로 적용했다 :. (PSGHL)을 당화 암모니아 섬유 확장 전처리 옥수수 여물 가수 분해물 (AFEX CSH)을 효소와 산 – 전처리 지팽이 가수 분해물의 술을 희석 11, 12 AFEX 전처리 기술로 개발되고있다묽은 산 전처리 가장 일반적으로 현재는 낮은 비용 기술을 나타내는 효소 당화위한 바이오 셀룰로오스 노출되도록 실시하면서 발효 억제제의 생산을 최소화한다. PSGHL는 전처리 후 남아있는 셀룰로오스로부터 분리하고 포도당에서 특징적으로 가수 분해 된 헤미셀룰로오스에서 자일 로스 풍부하지만 낮습니다. AFEX의 CSH 및 PSGHL 조성물은 진화 과정을 관리하는 데 이용 된 주요 측면에서 서로 다르다. AFEX CSH PSGHL은 (표 1)에 비해 아미노산 및 암모니아 질소원의 푸란 알데히드 및 아세트산 억제제 낮은하지만 높다. PSGHL는 주된 설탕을 사용할 수있는 자일 로스의 추가 도전을 선물한다. 따라서 PSGHL 특히, 가수 개선 자일 로스 활용 가능 효모의 상업적 사용을 방지 약점을 풍부하게하는 것이 적절하다. 심지어 기본 탄당 발효 효모 사이의 최적 설탕 xylo에 대한 의존도SE는 세포의 성장을 지원하기 위해 수리 더욱 도전 때문에 다양한 이유의 가수가된다 :. 의한 환원 불균형 대사 구조적 무결성 및 중단 셀 대폭 손상 될 영양소 결핍 억제제 9 질소 보충 특히 형태 아미노산은 발효의 중요한 운영 비용을 나타낼 수있다. 분리 선별 및 순위에 질소 보충의 영향은 지팽이 가수로 탐구했다.
향상된 개인은 S.의 자연적인 유전 적 다양성에 의존 다중 선택 압력을 사용하여 진화 인구 풍부한했다 이 다양한 가수 분해물, 에탄올 또는 UV 방사선에 노출에 의해 유도 stipitis 인구와 돌연변이. 선택 압력은 S.의 진화 과정을 탐구하는 병렬 및 직렬 적용되었다 성장하고 가수 분해물에 효율적으로 발효 할 수 원하는 파생 상품으로 stipitis(그림 1). 점점 도전 가수 분해물의 기능성 인구의 반복 배양이 중 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 희석 시리즈를 사용하거나 다른 PGSHL 20 % 고체로드에서 제조 된 마이크로 플레이트에서 수행 하였다. 연속 배양에서 자일 로스에 에탄올 도전 성장의 응용 프로그램은 더 자일 로스 활용의 억압을 에탄올 적은 감수성을 보여주는 표현형에 대한 풍부하여 AFEX의 CSH 적용 인구를 개선. 후자의 기능은 최근에 포도당 발효 다음 균주 NRRL Y-7124에 의해 펜 토스 이용에 문제가 나타났다. PSGHL 8 농축 다음 가수 분해물 기능을 확대 탐구했다.
S.의 추정 개선 파생 상품 stipitis NRRL Y-7124은 가장 일반적인 개체군에서 콜로니를 선택하는 응력 조건으로 희석 도금하에 농축하여 표적 진화 과정의 각 단계에서 분리 하였다. 차원 상대성능 지수 (RPI가)의 반응 속도가 적용된 다른 가수 분해물 형태와 영양 보충제 평가 하였다 전반적인 성능에 기초하여 변형을 평가하기 위해 사용되었다. 다양한 적응 절차의 성공은 S.의 기능을 향상시킬 수 있지만 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물의 stipitis 이전 undetoxified 가수 분해물에 경제적 인 에탄올 생산을 보여주는 균주는 이전에보고되지 않은 문서화되어있다. 13-17 진화 절차를 사용하여 여기보다 상세하게 시각화 할, Slininger 등. (18)는 크게 이상 향상 균주 개발 모 균주 NRRL Y-7124 및 AFEX의 CSH에> 40g / L의 에탄올을 생산하고 적절 질소원 보충 당화 지팽이 분해물 (SGH)를 효소 수있다. 이 새로운 균주는 에탄올 산업 개발 리그 노 셀룰로즈 향후 관심을 추가 유전체학 연구 건물의 과목과 같습니다이전 염기 서열을 변형 NRRL Y-11545의 사람들에. 19 균주 개량 연구를 촉진하기위한 전주곡으로 개발하는 동안 발생 유전 적 변화의 역사를 규명 할 그림 1에 도식화 진화의 여러 단계에서 생산 된 최고 균주의 게놈 연구.
Protocol
Representative Results
Discussion
몇 가지 단계가 발전 처리의 성공에 매우 중요했다. 첫째, 성공적인 응용 프로그램에 필요한 원하는 표현형으로 인구의 진화를 구동하기 위해 적절한 선택 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 다음 선택적 응력은 S. 위해 선택되었다 개발 stipitis 원하는 표현형 농축을 안내하도록 적절한 시간에 적용 : 12 % (아세트산 푸란 알데히드 및 다른 억제제 낮은 수준의 존재 하에서 성장하고 다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
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