Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri
Summary
Adaptif gelişimi ve izolasyon teknikleri tarif hızla heksoz ve enzimin pentoz karışık şekerler undetoxified hidrolizatlarını şekerleştirilir ve 40 g / L etanol içinde birikir tüketmek mümkün Scheffersomyces stipitis suşunun türevleri NRRL-Y-7124 elde etmek üzere gösterilmektedir.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Lignoselülozik biyokütle tahmini yıllık 1,3 milyar kuru ton etanol üretimini desteklemek ve ABD% 30, petrol tüketimini azaltmak için izin verebilir. 1 glikoz ve ksiloz zengin bitki biyokütle hidroliz verimleri şeker karışımları, fermantasyon inhibitörleri gerekli kimyasal ön tarafından oluşturulan rağmen hemiselüloz yıkmak ve enzimatik saldırı için selülozu ortaya çıkarmak. Asetik asit, furfural ve (HMF) hidroksimetilfurfural ön-muamelesi sırasında oluşturan birçok önleyicileri arasında temel bileşenleri olduğu düşünülmektedir. İleri lignoselülozik etanol endüstriyi için, araştırma ve prosedürler hayatta kalan ve etkili bir şekilde gerekli olan bu tür önleyici bileşikler varlığında heksoz ve pentoz şekerleri her ikisini de kullanmak fonksiyon görme yeteneğine sahip maya suşları evrimini izin vermek. Saccharomyces cerevisiae gibi geleneksel sanayi maya suşları, önemli bir ilave zayıf verimli fermen yetersizlikBitki biyokütle hidrolizatları kullanılabilir ksiloz t.
Pichia stipitis tip suşu NRRL Y-7124 (5773 CBS), son zamanlarda yeniden Scheffersomyces stipitis iyi etanol ksiloz fermente bilinen bir yerli pentoz fermantasyon mayası olduğunu. 2,3 burada izlenmiştir NRRL Y-7124 evrimi bu belgelenmiş oldu çünkü küçük ksilitol yan ürün ile birlikte, 40 g / l'den fazla ekonomik olarak etanol birikmesine ana maya kökü büyük bir potansiyele sahiptir. 4,5,6 uygun ortam, S. olarak stipitis NRRL-Y-7124 0.41 ± 0.06 g / g yüksek hücre yoğunluklu kültürleri (6 g / L hücreleri). 7,8 direnç bir verimle 40 saat (1.75 g / L / saat) 'de 70 g / L etanol üretir fermantasyon inhibitörleri, etanol, furfural ve HMF de 9 ve S. bildirilmiştir stipitis ticari ölçekli etanol Bluz mevcut en umut verici yerli pentoz fermente mayalar arasında yer olmuşturn lignoselüloz gelen. 10 Amacımız endüstriyel uygulamalar için uygun NRRL Y-7124 daha sağlam bir türevi doğru evrimi zorlamak için çeşitli undetoxified lignoselülozik hydrolyzates ve etanol seçilim baskıları uygulamak oldu. aranan geliştirilmiş özellikleri arasında anahtar konsantre hidrolizatları daha hızlı şeker alım hızları, daha etkin bir karışık şeker kullanımı için daha az diauxy ve etanol ve önleyicilerinin yüksek toleransları edildi. S. uygulanması undetoxified hidrolizatları için stipitis gibi overliming olarak hidrolizat detoksifikasyon süreçleri ile ilişkili ilave işletme giderini ortadan kaldırmak için araştırma önemli bir odak noktası oldu.
İki endüstriyel umut verici hidrolizatları evrimi zorlamak için uygulanmıştır. (PSGHL) şekerleştirilmiş amonyak fiber genişletme ön tedavi mısır koçanı hidrolisat (AFEX CSH) enzim ve asit-ön tedavi darı hidrolizat içki sulandırmak 11,12 AFEX ön teknolojisi geliştiriliyorseyreltilmiş asit ön en yaygın güncel en düşük maliyet teknolojiyi temsil eden enzimatik sakarifikasyon için selülozik biyokütle maruz uygulanan ederken, fermantasyon inhibitörlerinin üretimini en aza indirmek. PSGHL ön sonrası kalan selüloz ayrılabilir ve glikoz karakteristik hidrolize hemiselüloz gelen ksiloz zengin, ama düşüktür. AFEX CSH ve PSGHL kompozisyonlar evrim sürecini yönetmek için istismar edildi kilit yönlerini birbirinden farklıdır. AFEX CSH PSGHL (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında, amino asitler ve amonyum azot kaynakları furan aldehit ve asetik asit inhibitörleri düşük ancak daha yüksektir. PSGHL baskın şeker mevcut olan ksiloz ek bir meydan okuma sunuyor. Böylece PSGHL özellikle hidrolizatları geliştirilmiş ksiloz kullanımı için mevcut maya ticari kullanımını engelleyen bir zayıflık zenginleştirmek için uygundur. Hatta yerli pentoz fermantasyon mayaları arasında optimal şeker Xylo dayanmakse hücre büyümesini desteklemek ve onarım daha da zorlu nedenlerden dolayı çeşitli hidrolizatları kazanmaktadır. sebebiyle redoks dengesizlikler metabolizmaya yapısal bütünlüğünü ve bozulma hücre yaygın hasara neden besin eksiklikleri, inhibitörleri 9 Azot takviyesi, özellikle şeklinde amino asitler, fermantasyonlar için önemli bir işletme maliyetini temsil edebilir. izole tarama ve sıralama azot takviyesi etkisi darı hidrolizatları ile araştırılmıştır.
Geliştirilmiş bireyler S. doğal genetik çeşitliliği dayanan çoklu seçim baskıları kullanarak gelişmekte popülasyonda zenginleştirildi İki farklı hidrolizatları, etanol veya UV ışınlarına maruz kalma tarafından uyarılan stipitis nüfus ve mutasyonlar. Seçim basınçları S. evrimi ilerlemesini keşfetmek için paralel ve seri olarak uygulanmıştır büyümek ve hidrolizatları verimli fermente edebilir istenen türevleri doğru stipitis(Şekil 1). giderek daha zor hidrolizatları fonksiyonel popülasyonlarının tekrar kültür ya da% 12 glukan AFEX csh'ın bir seyreltme serisi kullanılarak ya da başka bir PGSHL% 20 katı yüklemede hazırlanan mikro-plakalar içinde gerçekleştirilmiştir. Sürekli kültüründe ksiloz üzerinde etanol-meydan büyüme uygulama daha ksiloz kullanımı baskıyı etanol daha az etkileniyor gösteren fenotipleri için zenginleştirerek AFEX CSH adapte popülasyonları düzeldi. İkinci özellik son zamanlarda glikoz fermantasyonu aşağıdaki NRRL Y-7124 ile pentoz kullanımına sorunlu gösterilmiştir. PSGHL 8 Zenginleştirme sonraki hidrolizat işlevselliği genişletmek için araştırılmıştır.
S. varsayılan gelişmiş türevleri stipitis NRRL Y-7124 en yaygın nüfus gelen koloniler almak için stres koşulları ve seyreltme kaplama kapsamında hedeflenen zenginleştirme kullanarak evrim sürecinin her aşamasında izole edilmiştir. boyutsuz akrabaperformans endeksleri (RPIs) kinetik davranış uygulanan farklı hidrolizat türleri ve besin takviyeleri değerlendirildi genel performansa dayalı suşları sıralamak için kullanıldı. Çeşitli adaptasyon prosedürlerinin başarıları S. işlevselliğini artırmak için olsa lignoselülozik hidrolizatları bölgesindeki stipitis önce undetoxified hidrolizatları, ekonomik etanol üretimi gösteren suşlar, daha önce rapor edilmemiş, belgelenmiştir. 13-17 evrimi prosedürler kullanılarak burada daha ayrıntılı olarak görüntülenmiştir için Slininger ve ark., 18 belirgin olarak üzerinde geliştirilmiş olup soyları geliştirilmiştir üst NRRL-Y-7124 ve AFEX CSH> 40 g / L etanol üretmek ve uygun nitrojen kaynakları ile takviye edilmiş şekerleştirilmiş switchgrass hidrolizatı (SGH) enzim edebiliyoruz. Bu yeni suşlar etanol endüstrisine gelişmekte olan lignoselüloz gelecekteki ilgi ve ek genomik çalışmalar binanın konular gibidirDaha önce sıralı NRRL Y-11545 olanlar üzerinde. 19 suş geliştirme araştırmaları ilerletmek için bir başlangıcı olarak gelişimi sırasında meydana gelen genetik değişikliklerin geçmişini aydınlatmak istiyorum Şekil 1'de diagramed evrimin çeşitli aşamalarında üretilen üst soyların bir genomik çalışması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birkaç adım evrim sürecinin başarısı için kritik idi. Birincisi, başarılı bir uygulama için gerekli olan istenilen fenotip doğru nüfus evrimi götürmek uygun seçim baskıları seçmek için anahtardır. Aşağıdaki seçici gerilmeleri S. seçildi gelişimi stipitis ve istenen fenotipleri için zenginleştirme yol uygun zamanlarda uygulanır:% 12 (asetik asit ve furan aldehitler ve diğer inhibitörleri düşük seviyelerde mevcudiyetinde büyüme ve çeşitli şekerlerin fermentasyonu k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
