Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol
Summary
Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Naar schatting jaarlijks 1,3 miljard droge ton lignocellulose kunnen ondersteunen de productie van ethanol en laat de VS om zijn verbruik van aardolie te verminderen met 30%. 1 Hoewel plantaardige biomassa hydrolyse opbrengst suiker mengsels rijk aan glucose en xylose, fermentatie-remmers worden gegenereerd door de chemische voorbehandeling nodig af te breken hemicellulose en bloot cellulose voor enzymatische aanval. Azijnzuur, furfural en hydroxymethylfurfural (HMF) wordt gedacht dat de belangrijkste onderdelen van de vele remmers die zich vormen tijdens de voorbehandeling zijn. Om de lignocellulosische ethylalcoholindustrie vooruit, onderzoek en procedures voor de ontwikkeling van giststammen staat te overleven en goed functionerende zowel hexose en pentose suikers in aanwezigheid van dergelijke remmende verbindingen nodig mogelijk. Een aanzienlijke extra zwakke traditionele industriële giststammen zoals Saccharomyces cerevisiae, is het onvermogen om efficiënt ferment de xylose in hydrolysaten van plantaardige biomassa.
Pichia stipitis type stam NRRL Y-7124 (CBS 5773), onlangs omgedoopt tot Scheffersomyces stipitis, is een inwoner pentose gistende gist die bekend is om xylose fermenteren tot ethanol. 2,3 De evolutie van de stam NRRL Y-7124 werd hier voortgezet omdat het is gedocumenteerd hebben het grootste potentieel van de inheemse giststammen economisch realiseerbare ethanol accumuleren van meer dan 40 g / l met weinig xylitol bijproduct. 4,5,6 bij optimale media, S. stipitis NRRL Y-7124 produceert 70 g / l ethanol in 40 uur (1,75 g / l / uur) Opbrengst 0,41 ± 0,06 g / g in hoge celdichtheid cultures (6 g / L-cellen). 7,8 Resistance gisting remmers ethanol, furfural, HMF en is ook gemeld, 9 en S. stipitis is gerangschikt onder de meest veelbelovende inheemse pentose-fermenteren gisten beschikbaar voor commerciële schaal ethanol production uit lignocellulose. 10 Ons doel was om diverse undetoxified lignocellulose hydrolysaten en ethanol selectie druk van toepassing zijn op de evolutie te dwingen in de richting van een meer robuuste derivaat van stam NRRL Y-7124 geschikt voor industriële toepassingen. Key onder zocht verbeterde functies waren sneller suiker opnamesnelheden in geconcentreerde hydrolysaten, verminderd diauxy efficiënter gemengd gebruik suiker, en hogere toleranties van ethanol en remmers. De toepassing van S. stipitis om undetoxified hydrolysaten was een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek naar de toegevoegde operationele kosten in verband met hydrolysaat detoxificatie processen, zoals overliming elimineren.
Twee industrieel veelbelovende hydrolysaten werden toegepast op de evolutie van kracht:. Enzym versuikerde ammoniak fiber-uitbreiding voorbehandelde maïsstro hydrolysaat (AFEX CSH) en verdunde zuur voorbehandeld switchgrass hydrolysaat drank (PSGHL) 11,12 AFEX voorbehandeling technologie wordt ontwikkeld omhet minimaliseren van de productie van fermentatie-remmers, terwijl verdund zuur voorbehandeling vertegenwoordigt de huidige laagste kosten-technologie het meest beoefend om cellulosehoudende biomassa bloot voor enzymatische versuikering. PSGHL kan worden gescheiden van de na voorbehandeling cellulose en is karakteristiek rijk aan xylose uit de gehydrolyseerde hemicellulose, maar weinig glucose. AFEX CSH en PSGHL composities van elkaar verschillen op essentiële aspecten die werden benut om de evolutie te beheren. AFEX CSH is lager in furan aldehyden en azijnzuur inhibitoren maar hoger in aminozuren en ammoniak stikstofbronnen opzichte PSGHL (tabel 1). PSGHL presenteert de extra uitdaging van xylose zijn de belangrijkste suiker beschikbaar. Aldus is PSGHL geschikt specifiek verrijken verbeterde xylose gebruik bij hydrolysaten, zwakte voorkomen commercieel gebruik van beschikbare gist. Zelfs onder autochtone pentose gisting gisten, de afhankelijkheid van de suboptimale xylo suikerse celgroei ondersteunen en reparatie wordt nog grotere uitdaging in hydrolysaten vanwege verschillende redenen. voedingsdeficiënties, remmers die grote schade aan structurele integriteit en verstoring metabolisme cel door redox onbalans 9 Stikstof suppletie, vooral in de vorm van aminozuren, kan een aanzienlijke bedrijfskosten voor fermentaties vertegenwoordigen. De impact van stikstof suppletie op isolate screening en ranking werd onderzocht met switchgrass hydrolysaten.
Verbeterde individuen werden verrijkt in een zich ontwikkelende bevolking met behulp van meerdere selectie druk afhankelijk van natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis bevolking en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. Selectiedruk werden parallel en in serie toegepast om de evolutie voortgang van S. staand stipitis in de richting van de gewenste derivaten kunnen groeien en efficiënt te gisten in hydrolysaten(Figuur 1). Het repetitieve kweken van functionele bevolking in toenemende mate uitdagende hydrolysaten werd bereikt in microplaten gebruik van een verdunningsreeks van een van beide 12% glucan AFEX CSH of anders PGSHL bereid bij 20% vaste stof belading. De toepassing van ethanol uitgedaagd groei op xylose in continue kweek verder verbeterd AFEX CSH deze populaties door verrijkend fenotypen tonen minder gevoeligheid voor onderdrukking van xylose gebruik ethanol. Deze laatste functie werd onlangs problematisch pentose gebruik getoond door stam NRRL Y-7124 na glucose fermentatie. 8 Verrijking op PSGHL werd vervolgens onderzocht om hydrolysaat functionaliteit uit te breiden.
Vermeende verbeterde derivaten van S. stipitis NRRL Y-7124 werd geïsoleerd uit elke fase van het evolutieproces via gerichte verrijking onder stressomstandigheden en verdunningsuitplatingstechniek kolonies kiezen de meest voorkomende populaties. dimensieloze relatievekengetallen (RPIs) werden gebruikt om stammen te scoren op basis van prestaties, waarbij kinetisch gedrag werd beoordeeld op verschillende hydrolysaat en voedingssupplementen toegepast. Hoewel het succes van verschillende procedures aangepast om de functionaliteit van S. verbeteren stipitis in lignocellulose hydrolysaten zijn eerder beschreven, stammen waaruit economische ethanolproductie op undetoxified hydrolysaten niet eerder gerapporteerd. 13-17 De evolutie procedures gevisualiseerd in meer detail hier Slininger et al. 18 ontwikkelde stammen die significant verbeterd de stam NRRL Y-7124 en kunnen produceren> 40 g / l ethanol in AFEX CSH en enzym versuikerde hydrolysaat vingergras (SGH) aangevuld met geschikte stikstofbronnen. Deze nieuwe stammen zijn van toekomstige belang zijn voor de ontwikkeling van lignocellulose ethanol industrie en onderwerpen van extra genomics studies gebouwop die van eerder gesequenced stam NRRL Y-11545. 19 A genomics onderzoek van top stammen geproduceerd tijdens de verschillende fasen van de evolutie diagramed in figuur 1 zou de geschiedenis van de genetische veranderingen die zich hebben voorgedaan tijdens de ontwikkeling als een prelude op stam verbetering onderzoek verder te ontrafelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende stappen waren cruciaal voor het succes van het evolutieproces. Ten eerste is het belangrijk passende selectiedrukken kiezen om de populatie evolutie drijven naar de gewenste fenotypen die nodig zijn voor een succesvolle toepassing. De volgende selectieve spanningen werden gekozen voor S. stipitis ontwikkeling en toegepast op geschikte tijdstippen verrijking leidraad voor de gewenste fenotypen: toenemende sterkte van 12% glucan AFEX CSH (die de groei en fermentatie van verschillende suikers dwingt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
