Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol
Summary
Adaptive Evolution und Isolationstechniken sind beschrieben und gezeigt , Derivate von Scheffersomyces stipitis – Stamm NRRL Y-7124 zu erhalten , die der Lage sind, schnell Hexose und Pentose – Zuckern in gemischten Enzym verbrauchen verzuckert undetoxified Hydrolysate und über 40 g / l Ethanol zu akkumulieren.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Schätzungsweise jährlich 1,3 Milliarden trockenen Tonnen Lignocellulose – Biomasse könnte die Ethanolproduktion und damit die USA zu verringern , seine Erdölverbrauch um 30%. 1 Obwohl pflanzliche Biomasse Hydrolyseausbeuten Zuckermischungen reich an Glucose und Xylose, Fermentationsinhibitoren erzeugt werden durch die chemische Vorbehandlung unterstützen notwendig Hemicellulose zu brechen und zu entlarven Cellulose für einen enzymatischen Angriff. Essigsäure, Furfural und Hydroxymethylfurfural (HMF) sind gedacht, Schlüsselkomponenten unter vielen Inhibitoren zu sein, die während der Vorbehandlung bilden. Um die Lignocellulose äthanolindustrie vorwärts zu bewegen, Forschung und Verfahren, um die Entwicklung von Hefestämmen zu ermöglichen, überlebensfähig und effizient sowohl Hexose und Pentose-Zuckern in Gegenwart solcher inhibitorischen Verbindungen nötig sind, um die Verwendung funktionieren. Eine signifikante zusätzliche Schwäche der traditionellen industriellen Hefestämmen, wie Saccharomyces cerevisiae, ist die Unfähigkeit , effizient ferment die Xylose in Hydrolysaten pflanzlicher Biomasse.
Pichia stipitis Typ – Stamm NRRL Y-7124 (CBS 5773), die vor kurzem umbenannt Scheffersomyces stipitis, ist eine native Pentose gärenden Hefe , die gut bekannt ist , Xylose zu Ethanol zu vergären. 2,3 Die Entwicklung der Stamm NRRL Y-7124 wurde hier verfolgt , weil es wurde dokumentiert von mehr als 40 g / l mit dem Nebenprodukt wenig Xylit haben das größte Potenzial von nativen Hefestämme wirtschaftlich gewinnbaren Ethanol zu akkumulieren. 4,5,6 bei optimalen Medien, S. stipitis – Stamm NRRL Y-7124 produziert 70 g / L Ethanol in 40 Stunden (1,75 g / L / h) bei einer Ausbeute von 0,41 ± 0,06 g / g in hochdichten Zellkulturen (6 g / l Zellen). 7,8 Resistance Fermentationsinhibitoren Ethanol, Furfural und HMF hat auch 9 und S. berichtet worden stipitis wurde unter vielversprechendsten nativen Pentose-fermentierenden Hefen für kommerziellen Maßstab Ethanol productio Platzn aus Lignocellulose. 10 Unser Ziel war es diverse undetoxified Lignocellulose – Hydrolysaten und Ethanol Selektionsdruck anwenden zu zwingen Entwicklung hin zu einem robusteren Derivat von Stamm NRRL Y-7124 geeignet für industrielle Anwendungen. Die wichtigsten unter verbesserten Features waren gesucht schneller Zucker Aufnahmeraten in konzentrierter Hydrolysate, reduziert diauxy für effizientere Mischzuckerverwertung und höhere Toleranzen von Ethanol und Inhibitoren. Die Anwendung von S. stipitis zu undetoxified Hydrolysate war ein Schwerpunkt der Forschung den zusätzlichen Betriebskosten mit Hydrolysat Entgiftungsprozesse, wie overliming assoziiert zu beseitigen.
Zwei industriell vielversprechende Hydrolysate wurden zu zwingen Evolution angewandt. Enzym verzuckerten Ammoniak Faser Expansion vorbehandelten Maisstroh – Hydrolysat (AFEX CSH) und Säure vorbehandelt Switchgrass- Hydrolysat Lauge (PSGHL) verdünnen 11,12 AFEX Vorbehandlungstechnologie entwickelt wird , umdie Herstellung von Fermentationsinhibitoren zu minimieren, während verdünnte Säurevorbehandlung stellt praktiziert die aktuelle niedrigsten Kosten-Technologie am häufigsten Zellulose-Biomasse zur enzymatischen Verzuckerung zu belichten. PSGHL ist trennbar von der Cellulose nach der Vorbehandlung verbleibenden und ist charakteristisch reich an Xylose aus dem hydrolysierten Hemicellulose, aber wenig Glukose. AFEX CSH und PSGHL Zusammensetzungen unterscheiden sich voneinander in wichtigen Aspekten, die die Evolutionsprozess zu verwalten ausgebeutet wurden. AFEX CSH niedriger in furan Aldehyde und Essigsäure Inhibitoren aber höher in Aminosäuren und Ammoniak Stickstoffquellen im Vergleich mit PSGHL (Tabelle 1). PSGHL stellt die zusätzliche Herausforderung von Xylose die vorherrschende Zucker zur Verfügung stehen. So ist PSGHL angemessen speziell in Hydrolysaten für verbesserte Xyloseverwertung zu bereichern, eine Schwäche kommerzielle Nutzung der verfügbaren Hefe zu verhindern. Auch unter den einheimischen Pentose gärenden Hefen, die das Vertrauen auf die suboptimale Zucker Xylose Zellwachstum zu unterstützen und die Reparatur wird noch schwieriger in Hydrolysaten wegen einer Vielzahl von Gründen. Nährstoffmangel, Inhibitoren große Schäden verursachen strukturelle Integrität zu Zelle und Unterbrechung Metabolismus aufgrund redox Ungleichgewichten 9 Stickstoffergänzung, insbesondere in Form von Aminosäuren können eine erhebliche Betriebskosten für Gärungen darstellen. Die Auswirkungen der Stickstoff-Supplementation auf Isolat Screening und Ranking wurde mit Switchgrass Hydrolysate erforscht.
Verbesserte Personen wurden in einer sich entwickelnden Bevölkerung mit mehreren Selektionsdruck angewiesen auf natürliche genetische Vielfalt des S. angereichert stipitis Bevölkerung und von Forderungen an zwei unterschiedlichen Hydrolysate induzierte Mutationen, Ethanol oder UV – Strahlung. Selektionsdruck wurden parallel und in Serie angewandt , um die Evolution Fortschritt von S. zu erkunden stipitis in Richtung gewünschten Derivate der Lage zu wachsen und effizient in Hydrolysaten gären(Abbildung 1). Die wiederholte Kultivierung von funktionellen Populationen in zunehmend herausfordernden Hydrolysate wurde erreicht, in Mikrotiterplatten einer Verdünnungsreihe von entweder 12% Glucan AFEX CSH Einsatz oder auch PGSHL bei 20% Feststoffbeladung hergestellt. Die Anwendung von Ethanol-herausgefordert Wachstum auf Xylose in einer kontinuierlichen Kultur weiter verbessert AFEX CSH angepasst Populationen von für Phänotypen Anreicherung demonstriert weniger Anfälligkeit Unterdrückung der Xyloseverwertung zu Ethanol. Letztere Funktion wurde vor kurzem als problematisch Pentose Nutzung durch den Stamm NRRL Y-7124 gezeigt folgenden Glucosevergärung. 8 Anreicherung auf PSGHL wurde neben Hydrolysat Funktionalität zu erweitern sucht.
Vermeintliche verbesserte Derivate von S. stipitis NRRL Y-7124 wurden von jeder Phase des Evolutionsprozesses isoliert Plattierung durch gezielte Anreicherung unter Stressbedingungen und Verdünnung Kolonien von den am weitesten verbreiteten Bevölkerung zu holen. dimensionslos relativPerformance-Indizes (RPI) wurden verwendet, um Stämme basierend auf die Gesamtleistung Rang, wo kinetische Verhalten auf den verschiedenen Hydrolysat-Typen und Nahrungsergänzungsmittel angewendet wurde bewertet. Auch wenn die Erfolge der verschiedenen Anpassungsverfahren die Funktionalität von S. zu verbessern stipitis in Lignocellulose – Hydrolysate wurden bereits dokumentiert, Zerrungen wirtschaftliche Ethanolproduktion auf undetoxified Hydrolysate zeigen bisher nicht berichtet worden. 13-17 die Evolutionsverfahren Verwendung näher visualisiert werden hier Slininger et al. 18 Stämme entwickelt , die deutlich verbessert werden über der Elternstamm NRRL Y-7124, und sind in der Lage von> 40 g / L Ethanol in AFEX CSH zu produzieren und verzuckerten Switch Hydrolysat (SGH) entsprechend ergänzt mit Stickstoffquellen Enzyms. Diese neuen Stämme sind von zukünftigen Interesse für die Entwicklung von Lignocellulose-Ethanol-Industrie und als Gegenstand weiterer Genomik Studien Gebäudeauf denen der zuvor Stamm sequenziert NRRL Y-11545. 19 während der verschiedenen Phasen der Evolution Eine Genomik Studie der Top – Stämme in Abbildung diagramed 1 erzeugt würde die Geschichte von genetischen Veränderungen aufzuklären , die während der Entwicklung als Auftakt fiel Stammverbesserung Forschung fördern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wurden mehrere Schritte für den Erfolg des Evolutionsprozesses entscheidend. Erstens ist es Schlüssel geeigneten Selektionsdruck zu wählen, die Bevölkerung Entwicklung hin zu der gewünschten Phänotypen zu fahren, die für die erfolgreiche Anwendung benötigt werden. Die folgenden punktuelle Belastungen wurden für S. gewählt stipitis Entwicklung und zu geeigneten Zeiten angewendet Bereicherung für die gewünschten Phänotypen zu führen: Erhöhung der Stärken von 12% Glucan AFEX CSH (das Wachs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
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