Intrycket cytologi av locket Torkar Area
Summary
We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.
Abstract
Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.
Introduction
Den mänskliga övre ögonlocket utför cirka 10.000 blinkar varje dag ett, med bara 1 – 2 mm smal konjunktival region motsätter sig ögongloben. På grund av dess avtorkning rörelse under blinkning, har denna del av locket marginalen benämnts den "locktorkar" region 2. Det antas att friktions ökas i detta område under vanliga blinkande, på grund av att locket torka över hela världen. Detta kan spela en betydande roll i okulär komfort. Kontaktlinsbärare i särskild erfarenhet okulär obehag och detta är en av de främsta orsakerna till att upphöra lins bära tre. När en kontaktlins placeras på ögat, har friktionskoefficienten mellan linsmaterialet och den okulära ytan visat sig ändra fyra. Det finns bevis som tyder på att torrhetssymptom kunde relateras till denna förändrade friktion 2,5,6.
Denna förening kan också återspeglas i kliniskt observerbara fenomen, särskilt lock wiper epitheliopathy (LWE), även kallad övre ögonlocket marginal färgning (ULMS) 6. LWE är ett tidigt tecken på okulär irritation och en potentiell prediktor för torr ögonsjukdom. Det observeras och mätas med den vitala färgning av de övre och undre lock marginalregioner. Även om detta betygssystemet 2 och dess kliniska giltighet (dvs korrelation med subjektiva symtom) är fortfarande under debatt, förblir okulär obehag en gåta för kliniker och forskare både och, viktigast av allt, en olägenhet för patienterna.
To-date, är lite känt om kliniskt relevanta varianter i (under) cellulär anatomi och fysiologi av locket torkarområdet 7 och endast en rapport använder sig av cytologiska metoder 8. Impression cytologi (IC) har använts i mer än 40 år för att samla in celler från epitel ytan av bulbär eller böjd bindhinna genom tillämpning av ett membran 9,10. Vid avlägsnande, de vidhäftande cellerna genomgå cytological färgning och mikroskopisk avbildning. På grund av den anatomiska och cellulära skillnader i locket torkar regionen kräver denna teknik optimering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Impression cytologi utförs typiskt på bulbarkonjunktiva, med hjälp av blandad cellulosaester membran. Prover skärs till storlek från bulkmaterialarken, steriliseras, anbringas och avlägsnas från den konjunktivala ytan med hjälp av pincett. Med användning av samma membranmaterial, var en kolv styrd IC-anordning nyligen utformade för att passa ytan geometri bulbarkonjunktiva och upprätthålla konstant tryck mellan program 13. Dessa metoder är ineffektiva för den smala, tydligt böjda lock torkar re…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.
Materials
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx’s line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. . Confocal microscopy. , 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
