Nous avons collecté, coloré et imagé des cellules de la conjonctive du bord interne de la paupière de sujets humains. En caractérisant la morphologie cellulaire et l’activité métabolique, cette méthode peut approfondir notre compréhension de la sécheresse oculaire et du rôle que le frottement entre les surfaces oculaires peut jouer dans la perception de l’inconfort oculaire.
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Article de méthode
Impression cytologie de la zone d'essuie-glace du couvercle
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il existe peu de rapports sur l’anatomie cellulaire de la zone de l’essuie-glace de la paupière interne et un seul rapport utilise des méthodes cytologiques. L’optimisation d’une méthode de collecte, de coloration et d’imagerie des cellules de la région LW à l’aide de la cytologie d’empreinte (CI) est décrite dans cette étude. Les cellules sont prélevées sur la surface interne de la paupière supérieure de sujets humains à l’aide de membranes hydrophiles en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et colorées avec des colorants cytologiques pour révéler la présence de cellules caliciformes, de mucines, de noyaux cellulaires et de divers degrés de pré- et de parakératinisation. Les colorants immunocytochimiques montrent une activité d’estérase cellulaire et des membranes cellulaires compromises par l’utilisation d’un microscope laser à balayage confocal. Jusqu’à 100 images numériques microscopiques sont capturées pour chaque échantillon et assemblées en une image haute résolution à grande échelle de l’ensemble de la portée du circuit intégré. Nous démontrons une sensibilité de la CI plus élevée que celle rapportée précédemment, appropriée pour identifier les morphologies cellulaires et l’activité métabolique dans la zone LW. À notre connaissance, c’est la première fois que cette sélection de colorants fluorescents est utilisée pour imager des membranes de circuits intégrés LW. Ce protocole sera efficace dans les études futures pour révéler des détails non documentés de la zone LW, tels que l’évaluation des particularités cellulaires des porteurs de lentilles de contact ou des patients atteints de sécheresse oculaire ou d’épithéliopathie par essuie-glace.
Introduction
La paupière supérieure humaine exécute environ 10.000 clignote chaque jour 1, avec seulement 1 - région conjonctival 2 mm étroite opposés du globe oculaire. En raison de son mouvement d'essuyage pendant le clignotement, cette partie de la marge de couvercle a été appelé le "couvercle essuie - glace" région 2. On suppose que le frottement est augmenté dans cette région pendant le clignotement habituelle, en raison du couvercle d'essuyage dans le monde entier. Cela peut jouer un rôle important dans le confort oculaire. Porteurs de lentilles de contact dans l' expérience particulière gêne oculaire et ceci est l' une des principales ....
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Protocole
déclaration éthique: Avant de recueillir les cellules de sujets humains, le consentement éclairé et l'approbation de l'éthique doit être obtenue.
1. Préparer Stain
NOTE: Préparer la tache le jour de l'expérience.
- Ajouter 5 ul d'éthidium (ou 4 uM) et 5 pi de calcéine AM (ou 4 uM) à 2,5 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans 15 ml tube de centrifugation; mélanger. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière et conserver à la température ambiante jusqu'à utilisation.
2. Cellules Collectionnez
- Retirer les insert....
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Résultats
La membrane de culture cellulaire sur enjambé le support en plastique est un outil pratique pour recueillir l'ordinateur de poche des cellules épithéliales de la conjonctive couvercle d'essuie-glace. Ce procédé élimine le besoin d'instruments stérilisés supplémentaires généralement utilisés pour préparer et gérer les membranes de circuits intégrés. La figure 1 représente le circuit intégré de la zone d'essuyage de couvercle au moyen d' un insert de cu.......
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Discussion
Impression cytologique est généralement effectuée sur la conjonctive bulbaire, en utilisant des membranes d'ester de cellulose mixte. Les échantillons sont coupés à la taille des feuilles de matériau en vrac, stérilisées, appliqué et retiré de la surface de la conjonctive à l'aide de pinces. En utilisant le même matériau de membrane, d' un dispositif à circuit intégré commandé par le piston a récemment été conçue pour correspondre à la géométrie de surface de la conjonctive bulbaire, et maintenir une pressio.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas de financement pertinent ou de conflits à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier notre collègue Dr. Jalaiah Varikooty qui a fourni des idées et une expertise sur le sujet de l’essuie-glace, ce qui a grandement aidé cette recherche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bleu Alcian, 1 % dans 3 % d’acide acétique | Sigma | B8438-250ML | |
| Hématoxyline, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Coloration de Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Coloration de Papanicolaou, Modifié EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Kit de viabilité/cytotoxicité vivante/morte | Technologies | L-3224 | contient de l’homodimère-1 d’éthidium et des colorants Calcein AM |
| Alcaine (0,5 % de chlorhydrate de proparacaïne) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 ; mm, PTFE hydrophile, 0,4 ; et micro ; m | EMD Millipore | PICM01250 ; | |
| Plats à fond en verre de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Références
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
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Réimpressions et autorisations
