Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Интерференция РНК на основе Исследование функции белка теплового шока 27 во время роговичного эпителиального заживление ран

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

Роговичные эпителиальные клетки (CECS) непрерывно пролил в слезную пленку, в то время как они одновременно заменяются клетками из лимба и роговицы эпителиальных базальных слоев. 1 Различные внешние факторы стресса могут вызывать апоптоз и слущивание центральноевропейских стран. 2 В белки теплового шока (HSP) высоко консервативны и могут быть разделены на два семейства в соответствии с размером молекул. 3 Наибольший семейство HSP включает HSP90, HSP70 и HSP60, а меньшая семейство включает в себя Hsp27. 4 фосфорилирование HSP27 , как известно, играют важную роль в выживании клеток и необходима для миграции клеток из - за роли этого белка в актина ремоделирования. 5-7 Поэтому мы попытались проверить потенциальную роль Hsp27 фосфорилирования в миграции ЦИК и апоптоза в модели в пробирке эпителиального заживления раны.

РНК-интерференция (RNAi) с использованием либо небольших или коротких интерферирующих РНК (миРНК) имеет GEnerated интерес как фундаментальной и прикладной биологии, так как она потенциально позволяет получить выражение любого интересующего гена быть разобранной. 8 При этом мы использовали Hsp27 конкретных миРНК для оценки вклада HSP27 в ЦИК заживление ран и апоптоза. Традиционные методы RNAi для генной нокдаун в клетках используют синтетические дуплексы РНК, в том числе двух немодифицированных 21-мерными олигонуклеотидами, которые могут быть собраны для создания миРНК. RNAi миРНК, которые мы использовали в этом настоящем исследовании является простой и высокоэффективный метод для трансфекции клеток, и этот реагент работает с различными линии иммортализованных клеток. В этом настоящем исследовании мы демонстрируем методы, используемые для этого анализа, в том числе анализа нуля индуцированной направленной раны, вестерн-блоттинга, трансфекции миРНК анализа, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточная линия

  1. Культура 10 6 теломеразы-увековечен эпителиальные клетки роговицы человека (HCECs) в 6-луночного планшета (плотность: 1039,9 клеток / мм 2) в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 атмосферы с использованием бронхиальную среду для роста эпителий (BEGM) до они достигают 95% слияния.

2. Вестерн-блот-анализ после создания эпителиальной Скретч Раны

  1. Серия стерильный 200 мкл пипетки по всей поверхности скважины сливающихся культивируемых HCECs четыре раза в блюдо в кабинете биологической безопасности (класс II, тип А2) и инкубировать HCECs отдельно в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО 2 в течение 1, 5, 10, 30, 60 и 120 мин.
  2. Используйте один 6-луночного планшета для шести различных образцов в зависимости от времени инкубации после роговичного эпителиального ранению.
  3. Промыть раненным HCEC монослоев три раза 1x PBS, а затем добавляют 2,0 мл BEGM в каждую лунку.
  4. Отделить HCECs с использованием 2мл 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на лунку в течение 5 мин, центрифуге при 900 х г в течение 5 мин в 15 мл пробирку, и аспирата трипсин-ЭДТА с использованием 1 мл пипетки.
  5. Приостановка HCECs с 1 мл 1x PBS и передавать их в 1,5 мл трубки.
  6. Центрифуга HCECs при 10000 мкг в течение 15 секунд и аспирата 1x PBS с использованием 1 мл пипетки.
  7. Ресуспендируют HCECs в 100 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (10 мМ Трис, 10 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 25 мМ NaF, 2 мМ Na 3 VO 4, 1 мМ фенилметансульфонилфторид [ФМСФ], ингибиторы протеазы [1 мкМ пепстатина А, 1 мкМ лейпептина и 0,1 мкМ апротинина] и 0,5% Тритон Х-100 [рН 7]) и хорошо перемешать.
  8. Инкубируйте клетки в течение 30 мин на льду, чтобы вызвать лизис клеток.
  9. Центрифуга лизатов при 4 ° С при 10000 х г в течение 15 мин, а затем передать супернатанты на свежий 1,5 мл пробирки (90 мкл аликвоты) и хранить их при температуре -80 ° С.
  10. Определение общей концентрации белка клеточных лизатов с использованием пр Bradfordotein анализ. 9
  11. Нагрузка 30 мкг общего белка клеточные в акриламидном геле, 10% или 12% для электрофореза додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем электрофоретически перенос разделенных полос белка на нитроцеллюлозных фильтрах с током 200 мА в течение 1 ч при 4 ° с использовать в Вестерн-блот-анализах.
  12. Блок нитроцеллюлозный фильтр мембраны с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) в течение 1 часа, добавляют первичный кроличьи поликлональные антитела против нефосфорилированный HSP27 (1: 1000 разведение) или первичный кроличьи поликлональные антитела против фосфорилированного HSP27 (1 : 1000 разбавление) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют в течение ночи мембраны при 4 ° с на качалке.
  13. Обнаружение иммунореактивных полос с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего (1: 10000 разведение) в 5% бычьего сывороточного альбумина, после промывки в течение 10 мин 3 раза TBST.
  14. Инкубируйте мембраны в вестерн-блоттинга люминола реагентов (6-7 мл на 10 см × 5 см мембраны) в течение 1 мин при комнатной температуре.
  15. Удалить мембрану из раствора реагента, удалить лишнюю жидкость с абсорбирующим полотенцем, и место в защитном пластиковом листе.
  16. Работая в темной комнате с безопасным светом, поместите покрытый мембраной в кассете пленки с боковой белком лицевой стороной вверх.
  17. Поместите рентгеновскую пленку поверх мембраны и подвергают в течение 1 мин.

3. миРНК Трансфекция Анализ 10

  1. HCECs культуре 5 × 10 5 клеток / лунку в 6-луночный планшет в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 атмосферы с использованием BEGM , пока они не достигнут 95% слияния.
  2. Развести трансфекции реагента (2,5 или 7,5 мкл) с 100 мкл уменьшенные сыворотки среды для трансфекции (коэффициент разбавления составлял 41 или 14.3) и растворения HSP27-специфических и вскарабкался управления миРНК в 100 мкл восстановленного сыворотки среды для создания 10 или 50 нМ HSP27 специфические и пополз управления миРНК.
  3. Смешайте 100 мкм; Л раствора киРНК с 100 мкл разбавленного реагента для трансфекции (соотношение 1: 1) и инкубировать смесь в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Добавьте миРНК-липидных комплексов с клетками. Затем через 4 ч Смена носителя для завершения BEGM и инкубировать клетки в течение 2-х дней при 37 ° С.
  5. Анализ трансфектированных клеток с помощью вестерн-блоттинга, как описано в разделах 4.1 до 4.7.

4. Вестерн - блот - анализа для миРНК-трансфецированных клеток 11

  1. Экстракт HSP27-специфичны и вскарабкался управления миРНК-трансфицировали HCECs в кабинете биологической безопасности с использованием 100 мкл ледяной буфер для лизиса (10 мМ Трис, 10 мМ NaCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 25 мМ NaF, 2 мМ Na 3 VO 4, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), ингибиторы протеазы, и 0,5% Тритон Х-100, рН 7).
  2. Инкубируйте клетки в течение 30 мин на льду, чтобы вызвать лизис клеток.
  3. Гранул лизатов при 10000 х г в течение 15 мин, а затем передать супернатанты на свежую 1,5 мл ваннеэс (90 мкл аликвоты) и хранить их при температуре -80 ° C.
  4. Определение концентрации белка лизатов клеток с использованием анализа Брэдфорда. 9
  5. Загружают образцы с равным количеством суммарных белков клеток на акриламидном геле 10% или 12%, подвергают гель на SDS-PAGE, и электрофоретически передавать разделенные полосы белка на нитроцеллюлозные фильтры с током 200 мА в течение 1 часа при 4 ° С до используют в Вестерн-блот-анализах.
  6. Блок нитроцеллюлозный фильтр мембраны с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) в течение 1 ч, добавляют первичные антитела против фосфорилированного и нефосфорилированном HSP27 (1: 1000 разведение), фосфорилированного Akt (1: 1000 разведение), нефосфорилированный Akt (1: 1000 разведение, использовали в качестве маркера для выживания клеток), Bcl-2-ассоциированных Х белок (1: 1000 разведение, использовали в качестве про-апоптотических белков) и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH; 1 : 200 разбавление, использовали в качестве контроля нагрузки) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), иинкубировать мембраны в течение ночи при 4 ° С на качалке.
  7. Обнаружение иммунореактивных полос с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего (1: 10000 разведение) в 5% бычьего сывороточного альбумина, после промывки 3 раза TBST, 10 мин каждой промывке.
  8. Инкубируйте мембраны в вестерн-блоттинга люминола реагентов (6-7 мл на 10 см × 5 см мембраны) в течение 1 мин при комнатной температуре.
  9. Удалить мембрану из раствора реагента, удалить лишнюю жидкость с абсорбирующим полотенцем, и место в защитном пластиковом листе.
  10. Работая в темной комнате с безопасного света, поместите покрытую мембрану в пленку кассеты стороной белка лицевой стороной вверх.
  11. Поместите рентгеновскую пленку на верхней стороне мембраны и выставить в течение 1 мин.

5. Скретч-индуцированной Направленная Ранение Анализ Оценка миграции клеток 12

  1. В кабинете биологической безопасности, сделать рану путем перетаскивания стерильной пипетки по всей поверхности скважины сливающихся культурHSP27 конкретных миРНК-трансфицировали или яичница управления миРНК-трансфицировали HCECs.
  2. Сразу после ранения, промыть клетки дважды с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и поддерживать их в BEGM культурах в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО 2 в течение 24 ч после ранения.
  3. Сфотографировать HCEC изображений с использованием прямой микроскоп при увеличении 100X 24 ч после ранения и выполнить фоне уплощение с помощью фильтра Команда в области программного обеспечения для анализа изображений.
  4. С помощью команды Select измерения, определить область интереса (AOI) с тем же размером многоугольной формы, которые могут охватывать перпендикулярно от конца до конца начальной раны, и определить три различных AOI в раненой области каждого образца.
  5. Автоматически подсчитать количество ячеек в каждой области, используя Count / размер опции меню Measure.

6. Проточная цитометрия Анализ Апоптоз

  1. Культура HSP27 специфичные миРНК-трансфицировали и контIRNA трансфицируются HCECs , содержащие каждый 10 нМ миРНК в концентрации 5 × 10 5 клеток / лунку в 6-луночные планшеты , пока клетки не достигают 95% слияния в 37 ° C инкубаторе с 5% атмосфере СО 2 в BEGM.
  2. Отделить HCECs с использованием 2 мл 0,25% трипсин-ЭДТА на лунку в течение 5 мин, центрифугируют при 900 х г в течение 5 мин в 15 мл пробирку, и аспирата трипсин-ЭДТА с использованием 1 мл пипетки.
  3. Промыть клетки дважды холодным PBS , а затем клетки вновь суспендируют в 1X связывающем буфере (0,1 М HEPES / NaOH [рН 7,4], 1,4 М NaCl, и 25 мМ CaCl 2) при концентрации 10 6 клеток / мл.
  4. Передача 100 мкл суспензии клеток (1 × 10 5 клеток) в культуральную пробирку 5 мл.
  5. Добавить 5 мкл флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный аннексина V и йодид пропидий 5 мкл.
  6. Осторожно вихре клетки и инкубировать их в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
  7. Добавить 200 мкл 1х буфера для связывания в каждую пробирку и анализируют клетки потоком Cytometer в течение 1 часа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выражение фосфорилированного HSP27 значительно увеличилось в 5, 10, и 30 мин после того, как царапины телесных повреждений по сравнению с разматывать HCECs 13. Вестерн - блот - анализ показал , что экспрессия фосфорилированной HSP27 и фосфорилированного Akt оба были значительно снижены, тогда как экспрессия Bax была значительно увеличена в Hsp27 специфических киРНК-трансфецировали HCECs (рис 1A-E). Выражение фосфорилируется HSP27 был уменьшен на 30% и 40% в 10 нМ и 50 нМ HSP27 специфических миРНК-трансфицировали клетки, соответственно, по сравнению с контрольными миРНК-трансфецированных клеток, но выражение фосфорилированного Hsp27 не был уменьшенной (рис 1A-B ). Кроме того, выражение нефосфорилированный HSP27 была снижена на 20% и 30% в 10 нМ и 50 нМ HSP27 специфических миРНК трансфицированные клетки, соответственно, но выражение нефосфорилированный HSP27 была не снижена (Рисунок 1А и C </ Сильный>).

Направленный анализ ранении царапать-индуцированное показал , что через 24 часа после ранения, HSP27-специфических киРНК-трансфицированных клеток при 10 и 50 нМ отмечались уменьшение миграции (Рисунок 2). Кроме того, HSP27-специфичные миРНК-трансфицировали HCECs подверглись более апоптотической и некротической гибели клеток по сравнению с контрольными вскарабкался миРНК-трансфицированных клеток методом проточной цитометрии (рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ Вестерн - блот с использованием антител против фосфорилированного HSP27 (п-Hsp27), нефосфорилированный HSP27 (не-п-HSP27), фосфорилированного Akt (п-Akt) в качестве маркера клеточного выживания, не фосфорилируется Akt (не п-Akt), Bcl-X 2eassociated белок (Бакс) в качестве про-апоптотических белков, и GAPDH (а). Выражение фосфорилированного и nonphosphorylated HSP27 и фосфорилируется Akt значительно снизилась (В - D), тем не менее, экспрессия Bax значительно увеличилась в Hsp27 специфических киРНК-трансфецировали HCECs (Е), по сравнению с наблюдаемым в контрольной киРНК-трансфицированных клетках (все р <0,05). Выражение фосфорилируется HSP27 был уменьшен на 30% и 40% в 10 нМ и 50 нМ HSP27 специфических миРНК-трансфецированных клеток по сравнению с притворным контролем, соответственно, но выражение фосфорилируется HSP27 не была снижена в 10 нМ и 50 нМ управления миРНК -transfected клетки (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: статистически значимые различия между группами (р <0,05). Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

"> фигура 2
Рисунок 2. Царапина-индуцированное направленного анализа ранив для оценки миграции клеток после ранения в миРНК-трансфицировали HCECs. Рану царапина был создан в контроле и HSP27-специфических киРНК-трансфицированных клетках (А). Клетки были удалены из «вытаскивали» областей. Через 24 часа после ранения, 10 и 50 нМ Hsp27 специфических киРНК-трансфецированных клеток выставлены более низкие количества мигрирующих клеток по сравнению с 10 и 50 контрольных нМ миРНК-трансфицированных клетках (В). ** И * указывают на статистически значимые различия между группами (р <0,05). Данные представлены в виде средних значений ± стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 <бр /> Рисунок 3. Проточная цитометрия 50 нМ вскарабкался управления миРНК и HSP27-специфических киРНК трансфицируются эпителиальных клеток роговицы человека (HCECs) , меченного аннексина V и PI (А и В). Процент от общего числа клеток в квадрантах соответствует ранних апоптотических клеток (аннексина V-положительные, так и ПИ-негативных клеток, В4, внизу справа), в конце апоптотических клеток (аннексина V-положительные и ПИ-положительных клеток, Q2, верхний правый), и отмершие клетки (аннексина V-отрицательных и PI-положительных клеток, Q1, верхний левый). Hsp27 конкретных миРНК-трансфекцию HCECs имели более апоптический и некротической гибели клеток , чем контроль миРНК-трансфецированных клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких финансовых или имущественных интересов, в каких-либо материалов или методов, упомянутых в данном исследовании.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Исследовательского Гранта Student (13-14) из Университета Ульсан колледжа медицины, Сеул, Корея и грант (2014-464) из Асан института наук о жизни, Сеул, Корея.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

Генетика выпуск 115 белок теплового шока 27 эпителий роговицы роговицы эпителиальные заживление ран эпителиальные клетки апоптоз эпителиальной миграции РНК-интерференции миРНК молекулярная биология
Интерференция РНК на основе Исследование функции белка теплового шока 27 во время роговичного эпителиального заживление ран
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter