細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織
Summary
この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
分枝形態形成として知られている分枝状の上皮組織の発達は、細胞由来の、物理的、及び環境因子によって調節されます。乳腺では、分枝形態形成は、細胞の遊走は、ツリー状のアーキテクチャを作成し、集団導かれ、それを通して反復的なプロセスです。最初のステップは、分岐開始および伸長1,2に続いて、乳管からの一次芽形成です。周囲の間質への枝の浸潤は思春期でのステロイドホルモンの全身放出によって誘発されます。新しいプライマリ芽は、既存の枝の末端から開始し、このプロセスは、上皮ツリー3を作成し続けています。多くの重要な生化学的シグナルが同定されているが、この複雑な発達過程を導く細胞生物学的メカニズムの包括的な理解が現在欠如しています。また、特定の手がかりの影響に関するメカニズムの研究はexperiから解体することは困難ですin vivoでのメントは、などの正確な時空間摂動および測定がしばしば可能ではありません。
例えば全器官培養、プライマリオルガノイド、および細胞培養モデルとして3次元（3D）培養技術は、体系的に組織形態形成4-6のメカニズムを調査するための有用なツールです。これらには、移動、増殖、および分化を含む細胞挙動の様々な、このような機械的な力および生化学的信号として、個別に特定の因子の影響を決定するために特に有用である。6操作された細胞培養モデル、特に、容易に摂動を可能にします個々の細胞とその微小環境の。
そのような培養モデルは、一貫して再現性Aで誘導された場合、まとめ移行枝を形成する制御3D構造を持つモデル乳腺上皮組織を操作するための微細加工ベースのアプローチを使用していますppropriate成長因子。モデルの主な利点は、正確に操作し、このような高い統計的信頼と機械的ストレスのパターン、などの物理的および生化学的因子の効果を測定する能力です。この技術は、一緒に計算モデルと、既に乳房上皮組織の正常な発達および他方の分岐上皮7-11の指導における物理的および生化学的シグナルの相対的な寄与を決定するために使用されています。ここに提示することは、容易に細胞と細胞外マトリックス（ECM）ゲルの他のタイプに拡張することができ、これらのモデル組織を構築するための詳細なプロトコルであり、治療の試験のための潜在的なツールとして機能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（HL118532、HL120142、CA187692）、デビッド＆ルシール・パッカード財団、カミーユ＆ヘンリードレフュス財団、バロウズからの助成金によって部分的にサポートされていたが、ファンドへようこそ。 ASPは、シャーロットエリザベスプロクター敬語フェローシップによって部分的にサポートされていました。
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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