Visualisering av HIV-1 Gag Binding til Giant unilamelære vesikkel (GUV) Membraner
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
Den strukturelt protein av HIV-1, Pr55 Gag (eller gag), binder til plasmamembranen i cellene under viruset monteringsprosessen. Membran binding av Gag er et vesentlig skritt for virus partikkeldannelse, siden en defekt i Gag membran bindende resulterer i alvorlig svekkelse av viral partikkel produksjon. For å få mekanistiske detaljer av Gag-lipid membran interaksjoner, in vitro fremgangsmåter basert på NMR, protein footprinting, overflate-plasmonresonans, liposom flotasjon sentrifugering, eller fluorescens lipid vulst-binding er blitt utviklet hittil. Men hver av disse in vitro metoder sine begrensninger. For å overvinne noen av disse begrensningene, og tilveiebringe en komplementær måte til den tidligere etablerte metoder, har vi utviklet en in vitro-analyse hvor interaksjoner mellom HIV-1 Gag og lipidmembraner finne sted i en "celle-liknende" miljø. I denne analysen Gag binding til lipidmembraner er visuelt analysert ved hjelp av YFP-tagged Gag syntetisert i en hvetespirer basert in vitro oversettelse system og GUVs utarbeidet av en electroformation teknikk. Her beskriver vi bakgrunnen og protokoller for å oppnå Myristoylated full-lengde Gag proteiner og Guv membraner som er nødvendig for analysen og å detektere Gag-GUV binding ved mikroskopi.
Introduction
Humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) er et omhyllet virus som samler ved og knopper fra plasmamembranen (PM) i de fleste celletyper. Sammenstillingen av HIV-1 viruspartikler er drevet av 55 kDa-viralt kjerne-protein som kalles gag Pr55 (gag). Gag blir syntetisert som en forløper polyprotein bestående av fire store strukturelle domener, nemlig matrise, kapsid, nukleokapsid, og p6, samt to avstands peptider SP1 og SP2. Under montering, er den matrise (MA) domenet er ansvarlig for målretting av Gag til sammenstillingen området, kapsidet (CA) domene medierer Gag-Gag interaksjoner, nukleokapsidet (NC) domene rekrutterer viralt genomisk RNA, og p6 rekrutterer vertsfaktorer som hjelpemiddel viruspartikkel spalting fra plasmamembranen. Gag undergår også en ko-translasjonell modifikasjon ved tilsetning av en 14-karbon fettsyre eller myristat-del ved sin N-terminale ende.
Membranbinding av Gag er en viktig forutsetning for den virale montering, ettersom mutants som er defekt i membranbinding ikke klarer å produsere viruspartikler. Vi og andre har vist at membranbinding av Gag er mediert av todelte signaler i MA domene: N-terminal myristat enhet som formidler hydrofobe interaksjoner med det ytre lipid bilaget og en klynge av basiske residuer innenfor MA domene betegnet som meget basisk region ( HBR) som samhandler med sure lipider på PM 1-4. Studier av Gag-membran interaksjoner ved hjelp ektopisk ekspresjon av polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV) et enzym som katalyserer hydrolysen av PM-spesifikk sure fosfolipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] til fosfatidylinositol-4-fosfat, i celler antydet at Gag-PM lokalisering medieres av PI (4,5) P-2 3,5. Men in vitro-studier med sikte på å forstå mer mekanistiske detaljer om Gag-PI (4,5) P 2 interaksjoner har vist seg å være utfordrende for en rekke årsaker. TilEksempelvis har rensing av full-lengde Myristoylated HIV-1 Gag for biokjemiske forsøk vært teknisk vanskelig i det minste delvis på grunn av tendensen til Gag til å aggregere under rensingen. Derfor, avkortede former av HIV-1 Gag, slik som Myr-MA eller Myr-MA-CA, eller den ikke-Myristoylated formen er ofte blitt benyttet i studier som nødvendig Gag rensing (for eksempel kjernemagnetisk resonans, proteinspor, og overflate plasmonresonans 6-9). Alternativt koblet in vitro transkripsjon oversettings-reaksjoner har vært anvendt for å produsere fullengde Myristoylated HIV-1 Gag i andre biokjemiske studier 1,2. Typisk i dette system blir et gag-kodende plasmid transkribert og oversatt med eukaryote cellelysatene (f.eks kanin retikulocytt-lysater) som er blottet for enhver cellemembraner og messenger RNA, men inneholder maskineri for transkripsjon og translasjon. Etter reaksjonen blir cellelysater inneholdende gag blandet med megmbranes for analyse av Gag samhandling med lipider. I tillegg til den enkle fremstilling av full-lengde Myristoylated Gag, metoder ved hjelp av in vitro transkripsjon oversettelsessystem ha en fordel at Gag-syntesen og påfølgende membranbindings reaksjoner finner sted i en "eukaryot cytosol-lignende miljø som kan representere bedre fysiologiske betingelser. Denne egenskapen har bidratt til studier som viste at RNA-molekyler bundet til MA domene regulere Gag binding til sure lipider i en konkurransedyktig måte 1,2,10-12. Ettersom den totale mengde av Gag proteiner erholdt i disse cellelysatene er ikke høy, er nødvendig for deres påvisning metabolske merking av proteiner med radioaktivt merkede aminosyrer.
Avhengig av fremgangsmåten for å måle Gag-lipid interaksjonene, har en rekke membranpreparater blitt benyttet. Hver av disse metodene har sine styrker og begrensninger. De NMR-baserte analyser som krever bruk av lipider med korte acylkjettinger som er vannoppløselige (for eksempel, C4 og C8-PI (4,5) P 2) 6,8. Mens NMR-metoder for å teste bindingen av Gag til lipidene som har lang acylkjeder som finnes i celler som er under utvikling, har de vært benyttet bare med Myristoylated eller nonmyristoylated MA hittil 8,13. Alternativt kan liposomer fremstilt fra lipider som har tilpassede lengde acylkjeder er blitt anvendt i biokjemiske metoder som liposomer flotasjon eller fluorescerende liposom vulst bindingsanalyser 2,3,10,14-16. Imidlertid liposomene anvendt i disse analysene har små diametre, og dermed deres membraner har bratte og positivt kurvaturer. I motsetning til dette, i løpet av den tidlige fase av partikkelsammenstillingen i HIV-1-infiserte celler, Gag binder til PM, som er nesten plant på omfanget av Gag, og deretter induserer negativ krumning i løpet av spirende. Derfor kan liposommembranene med bratt og positiv krumning ikke være ideelt lipidbilagene å studere Gag-lipid interaksjoner. Som for liposom flotasjon analyser, er et annet potensielt forbeholdet at eksponering av Gag-lipidkomplekser til hyperton sukrose gradient under sentrifugering vil kunne påvirke den eksperimentelle utfallet. For å avhjelpe disse begrensningene og tilveiebringe en komplementær eksperimentelt system, er analyser for gag-binding til store unilamellære vesikler (GUVs) blitt utviklet i de senere år. GUVs er single lipidbllag vesikler som diameter utvide til flere titalls mikrometer. Således krumningen av disse membranene ligner PM på omfanget av Gag. Videre, på grunn av sin store størrelse som muliggjør visuell inspeksjon etter optiske mikroskoper, membran binding av fluorescerende merket eller merkede GAG-proteiner til disse vesiklene etter blanding kan lett bestemmes uten etterfølgende prosessering av gag-lipidkomplekser.
Vi her beskrive en protokoll for å studere HIV-1 Gag membranbinding ved hjelp GUVs hentet fra en electroformation metode. Ulike metoder som milde hydrering, gel-assistert hydrering, microfluidic jetting, og electroformation 17-22 har blitt brukt til å skaffe GUVs. For protokollen beskrevet her, er det electroformation metoden som brukes først og fremst på grunn av sin effektivitet i å danne GUVs med sure lipider og dens relative brukervennlighet uten behov for kostbare oppsett. Siden visualisering av Gag nødvendiggjør en fluorescerende reporter, blir gul fluorescerende protein (YFP) genetisk tilsatt til den C-terminale ende av Gag (Gag-YFP). Gag-YFP proteiner oppnås ved in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjoner i hvetespirer lysatene basert på kontinuerlig utveksling-kontinuerlig strøm (CECF) teknologi. I denne teknologien, er begge fjerning av hemmende biprodukter av reaksjonene og tilførsel av reaksjons substrater og energikomponenter oppnådd i en dialysebasert mekanisme. For disse reaksjoner er et plasmid som koder for gag-YFP under kontroll av en T7-promoter anvendt. Av notatet, som vist tidligere, hvetekim lysatene støtter myristoylation uten tilleggskomponenter 23,24. Ved hjelp av denne metoden, har det vært mulig å få tilstrekkelige mengder av full lengde Myristoylated Gag-YFP til visualisering av Gag på GUV membraner 24. Her beskriver vi protokollen som HIV-1 Gag binding til PI (4,5) P 2-holdig GUV membraner kan bli undersøkt uten langvarig etterfølgende behandling etter bindende reaksjoner og foreslå at metoden utfyller allerede eksisterende Gag-membran bindingsanalyser og kan være utvidet til ytterligere å forstå HIV-1 Gag-membranbinding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den GUV bindingsanalysen som beskrevet ovenfor gir et godt alternativ i situasjoner hvor andre protein-lipid-interaksjonsanalyser har sine begrensninger. Denne analysen kan vi undersøke interaksjoner mellom Myristoylated helaftens Gag og sure lipider med mors lengde acylkjeder i lipid bilaget sammenheng og gjøre det uten lang flytesentrifugering gjennom høy tetthet sukrosegradienter eller andre post-bindende behandling av Gag-lipid komplekser. En annen fordel er at virkemåten til Gag kan undersøkes i en kompleks bl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Mohammad Saleem, Jing Wu og Krishnan Raghunathan for nyttige diskusjoner. Vi takker også Priya Begani for assistanse under filmingen. Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health gir R01 AI071727 (AO) og R01 GM110052 (til SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochimie. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochimie. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochimie. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
