Визуализация ВИЧ-1 Gag Связывание с Giant однослойные везикулы (ГУВ) Мембраны
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
Структурный белок ВИЧ-1, Pr55 Затычка (или ГАГ), связывается с плазматической мембраной в клетках в процессе сборки вируса. Мембрана связывание Gag является важным шагом для формирования вирусной частицы, так как дефект в Gag мембраны связывания приводит к тяжелым нарушениям производства вирусных частиц. Чтобы получить подробную информацию о механистической Gag-липидных мембранных взаимодействий, методы в пробирке на основе ЯМР, белка футпринтинга, поверхностного плазмонного резонанса, липосомная флотационного центрифугирования или флуоресценции липидного бусинки связывания были разработаны до сих пор. Тем не менее, каждый из этих методов в пробирке имеет свои ограничения. Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений и обеспечить дополнительный подход к ранее установленным методам, мы разработали анализ в пробирке , в которой взаимодействие между ВИЧ-1 Gag и липидных мембран происходят в среде "клеточноподобного". В этом анализе, Затычка связывание с липидными мембранами визуально анализируют с использованием YFP-tagged Gag синтезируется в зародышей пшеницы на основе в пробирке системы перевода и GUVs , приготовленных с помощью методики electroformation. Здесь мы опишем фона и протоколы для получения myristoylated полнометражных Gag белки и ГУВ мембраны, необходимые для анализа и выявления Gag-ГУВ связывания с помощью микроскопии.
Introduction
Человеческий вирус иммунодефицита типа 1 (ВИЧ-1) представляет собой оболочечный вирус, который собирает в и почки из плазматических мембран (ПМ) в большинстве типов клеток. Сборка вирусных частиц ВИЧ-1 приводится в движение с помощью вирусного белка ядра 55 кДа под названием Pr55 Затычка (ГАГ). Gag синтезируется в виде полипротеина предшественника, состоящего из четырех основных структурных доменов, а именно, матрица, капсида, нуклеокапсиде и P6, а также два распорных пептидов SP1 и SP2. Во время сборки матрица (MA) домен отвечает за нацеливание Gag к месту сборки капсида (CA) домен опосредует Gag-Gag взаимодействий, нуклеокапсида (NC) домена вербует геномной РНК вируса и P6 новобранцы принимающие факторы, которые содействуют вирус разрезка частиц из плазматической мембраны. Затычка также подвергается со-трансляционной модификации путем добавления жирной кислоты 14-углерода или миристатной фрагмента на его N-конце.
Мембрана связывание Gag является необходимым условием для вирусной сборки, так как тutants, которые имеют дефекты в мембране связывания не производят вирусные частицы. Мы и другие показали, что мембраны связывание Gag опосредуется двудольных сигналов в пределах домена Массачусетс: N-концевой миристат фрагмент, который опосредует гидрофобные взаимодействия с липидный бислой и кластером основных остатков в домене МА называется, как высоко основной области ( HBr) , который взаимодействует с кислыми липидами на ПМ 1-4. Исследования Gag-мембранных взаимодействий с использованием эктопической экспрессии polyphosphoinositide 5-фосфатазы IV (5ptaseIV), фермент , который катализирует гидролиз PM-специфической кислой фосфолипидного phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] к фосфатидилинозитол-4-фосфат, в клетках предположил , что локализация Gag-ПМ опосредуется PI (4,5) P 2 3,5. Тем не менее, в пробирке исследования , направленные на понимание более механистические детали Gag-PI (4,5) P 2 взаимодействия оказались быть сложным по целому ряду причин. ДляНапример, очистка полнометражных myristoylated ВИЧ-1 Затычка для биохимических экспериментов было технически сложно, по крайней мере частично из-за тенденции ГАГ агрегировать во время очистки. Следовательно, усеченные формы ВИЧ-1 Gag, такие как Myr-MA или Myr-MA-CA, или не-myristoylated форме были часто используются в исследованиях , которые требуют Gag очистки (например, ядерный магнитный резонанс, белок футпринтинга, и поверхность плазмонного резонанса 6-9). В качестве альтернативы, в сочетании в пробирке реакций транскрипции-трансляции, были использованы для получения полной длины myristoylated ВИЧ-1 кляп в других биохимических исследований 1,2. Как правило , в этой системе, плазмиду Затычка-кодирование транскрибировать и транслировать с эукариотические лизаты клеток (например, кролик лизатов ретикулоцитов), которые лишены каких – либо клеточных мембран и с матричными РНК , но содержат механизм для транскрипции и трансляции. После реакции, клеточные лизаты, содержащие Gag смешиваются со мнойmbranes для анализа Gag взаимодействий с липидами. В дополнение к легкости приготовления полной длины myristoylated Затычка, методы , использующие систему перевода в пробирке транскрипции имеют преимущество , что синтез Затычка и последующее мембранные реакции связывания происходят в 'эукариотической цитозоле типа "среды , которая может лучше представлять физиологических условиях. Это свойство способствовало исследований , которые показали , что молекулы РНК , связанные с доменом MA регулируют Gag связывания с кислыми липидов на конкурентной основе 1,2,10-12. Тем не менее, так как общее количество Gag белков, полученных в этих клеточных лизатов не высоки, метаболическое мечение белков с радиоактивно меченных аминокислот необходимо для их обнаружения.
В зависимости от метода измерения Затычка-липидных взаимодействий, которые были использованы разнообразные мембранных препаратов. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки. Большинство анализов ЯМР на основе требуют использования липидов с коротким ацилцепи , которые растворимы в воде (например, С4 и С8-PI (4,5) P 2) 6,8. В то время как ЯМР – методы тестирования связывание Gag с липидами , которые имеют длинные ацильные цепи , найденные в клетках на стадии разработки, они были использованы только с myristoylated или nonmyristoylated MA до сих пор 8,13. В качестве альтернативы, липосомы , приготовленные из липидов , которые имеют родные длины ацильных цепей были использованы в биохимических методов , таких как липосомы флотацией или флуоресцентного липосомного буртика анализы связывания 2,3,10,14-16. Тем не менее, липосомы, используемые в этих анализах имеют небольшие диаметры, и, таким образом, их мембраны имеют крутые и положительную кривизну. В противоположность этому, на ранней стадии сборки частиц ВИЧ-1-инфицированных клеток, Gag связывается с ПМ, который почти Planar по шкале Gag, а затем вызывает отрицательную кривизну во время бутонизации. Таким образом, мембраны липосом с крутыми и положительной кривизны не может быть идеальным липидные двухслойные для изучения Gag-липидных взаимодействий. Что касается липосом FlotAtion анализы, еще один потенциальный нюанс в том, что воздействие Gag-липидных комплексов до гипертонического градиент сахарозы во время центрифугирования может повлиять на экспериментальный результат. Чтобы смягчить эти ограничения и предоставить дополнительную экспериментальную систему, анализы для Gag связывания с гигантскими однослойные везикулы (GUVs) были разработаны в последние годы. GUVs единичные липидный бислой везикул, диаметр которых распространяется на несколько десятков микрометров. Таким образом, кривизна этих мембран напоминает ПМ по шкале Gag. Кроме того, из-за его большого размера, что позволяет визуальный осмотр под оптическим микроскопом, мембрана связывание флуоресцентно помеченная или меченых белков Gag этих везикул при смешивании можно легко определить без последующей обработки Gag-липидных комплексов.
Мы здесь опишем протокол для изучения ВИЧ-1 Gag мембрану связывания с использованием GUVs, полученные из метода electroformation. Различные методы, такие как нежный гидратации, гель-помощь гидратации, микрофонrofluidic струйное и electroformation 17-22 были использованы для получения GUVs. Для протокола, описанного здесь, метод electroformation используется в первую очередь из-за его эффективности в формировании GUVs с кислыми липидами и его относительной простоте использования без необходимости дорогостоящих установок. Поскольку визуализация Gag требует флуоресцентного репортеру, желтый флуоресцентный белок (YFP) генетически добавлен к С-концу Gag (ГАГ-YFP). Gag-YFP белки получают в пробирке транскрипции и трансляции реакций в зародышей пшеницы лизатов на основе технологии непрерывного обмена-непрерывным потоком (CECF). В этой технологии, как удаление ингибирующих побочных продуктов реакции и операции подачи субстратов реакции и энергетических компонентов достигаются в механизме диализной основе. Для этих реакций, используют плазмиду, кодирующую Gag-YFP под контролем промотора Т7. Следует отметить, что, как было показано ранее, зародыши пшеницы лизаты поддерживают миристоилированию без дополнительных компонентов 23,24. Используя этот метод, удалось получить достаточное количество полнометражных myristoylated Gag-YFP для визуализации Gag на ГУВ мембран 24. Здесь мы опишем протокол , с которым ВИЧ-1 Gag связывания с PI (4,5) P 2 -содержащие ГУВ мембраны могут быть рассмотрены без длительной последующей обработки следующие реакции связывания и предполагают , что этот метод дополняет существовавшие ранее Gag-мембраны анализов связывания и может быть расширен для более глубокого понимания связывания ВИЧ-1 Gag-мембрану.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ связывания ГУВ, как описано выше, обеспечивает хорошую альтернативу в сценариях, где другие белково-липидных анализы взаимодействия имеют свои ограничения. Этот анализ позволяет изучить взаимодействие между myristoylated полнометражного Gag и кислых липидов с носителями длины ацильн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Мохаммад Салем, Цзинь Ву и Кришнан Рагунатан за полезные обсуждения. Мы также благодарим прия Begani за помощь во время съемок. Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01 AI071727 (для АО) и R01 GM110052 (для SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochimie. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochimie. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochimie. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
