משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli
Summary
פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.
Abstract
הדמית פקיק ישירה מדמיינת את שורש אוטם תרומבואמבוליים. יכולת פקיק תמונה ישירות מאפשרת הרבה יותר טוב חקירת השבץ מאשר להסתמך על מדידות עקיפות, ותהיה כלי מחקר כלי דם חזק ויציב. אנו משתמשים בגישה הדמיה אופטית כי תוויות thrombi בטוש פקיק הדמיה מולקולרית – פלורסנט Cy5.5 האינפרה-אדום קרוב (NIRF) בדיקה מקושרת קוולנטית גדילי הפיברין של פקיק ידי פעולת אנזימטית crosslinking-הפיברין של XIIIa גורמת קרישה המופעלת במהלך התהליך של התבגרות קריש. טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (microCT), גישה מבוססת משתמשת חלקיקי זהב שוחרת פקיק (AuNPs) פונקציונליות כדי למקד המרכיב העיקרי של קריש: הפיברין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בשילוב in vivo microCT לשעבר vivo NIRF הדמיה של thromboemboli במודל של עכברים לשבץ תסחיפי. אנו מראים כי in vivo </ em> microCT ו AuNPs גליקול-chitosan במיקוד הפיברין (FIB-GC-AuNPs) יכול לשמש המאפשר הדמיה הן thrombi באתרו thrombi תסחיפי מוחין. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של in vivo הדמית פקיק הישיר מבוסס microCT לפקח על ההשפעות הטיפוליות הסדרה של thrombolysis בתיווך activator plasminogen רקמות. לאחר פגישת ההדמיה האחרונה, אנחנו מדגימים ידי vivo לשעבר NIRF הדמיה במידה וחלוקת thromboemboli שיורית במוח. לבסוף, אנו מתארים תמונה ניתוחים כמותיים של נתוני הדמיה microCT ו NIRF. הטכניקה בשילוב של הדמית פקיק ישירה מאפשרת שתי שיטות עצמאיות של ויזואליזציה פקיק שתשווינה: באזור של אות ניאון הקשורות פקיק על vivo לשעבר NIRF הדמיה לעומת היקף thrombi microCT hyperdense in vivo.
Introduction
אחד מכל 6 אנשים לוקה בשבץ בשלב כלשהו בחייהם. שבץ איסכמי הוא ללא ספק סוג השבץ הנפוץ ביותר, והוא מהווה כ -80 אחוזים מכלל מקרי השבץ. בגלל thromboemboli לגרום רוב שבץ איסכמי אלה, יש עניין גובר בתחום ההדמיה פקיק ישיר.
ההערכה היא כי כ -2 מיליון תאי מוח מתים במהלך כל דקה של חסימה בעורק באמצע מוחין 1, מה שמוביל את הסיסמה "הזמן הוא המוח". ניתן לעשות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) מחקרים במהירות, והם זמינים באופן נרחב; מסיבה זו, CT נשאר ההדמיה שבה נקט באבחון וטיפול הראשוני של שבץ איסכמי hyperacute. CT הוא בעל ערך במיוחד עבור ליידע את ההחלטות המוקדמות הקריטיות: מתן activator plasminogen רקמות (tPA) עבור thrombolysis ו / או triaging אל יחזור קריש 2 endovascular. הדמית פקיק הנוכחית מבוסס CT, לעומת זאת, לא ניתן לעקוב אחר סדרה cerebral thromboemboli in vivo, כי היא משתמשת בשיטות עקיפות להפגין thrombi: לאחר עכירות של ברכת הדם לעומת זאת עם יוד, את thrombi מתואר כבעלי מילוי פגמי הכלי. קיימות מגבלות מינון וסיכונים הקשורים במתן החוזר של ניגוד עם יוד, אשר ימנעו חזרו הדמיה של thrombi בצורה זו.
לפיכך, יש צורך קריטי עבור מתודולוגיה הדמיה ישירה thrombi מוחות בחולי שבץ מוחי, כדי לאפשר מהר והחלטות טיפול טובות יותר להתבצע. אנו מציעים לעשות זאת על ידי הגדלת ערכן של CT, באופנות הדמיה החזית המשמש כיום לשבץ, עם השימוש סוכן הדמיה מולקולרית nanoparticular שוחרת פקיק.
אנחנו הוכחנו את השימוש של סוכן באמצעות טומוגרפיה מייקרו ממוחשב (microCT) חברה לשעבר vivo ברזולוציה גבוהה או in vivo (חיה קטנה) גרסת הדמיה של CT המאפשרת רכישת נתונים מהירים <sup> 3,4. אפילו עם ניגוד הרקמות הרך העני יחסית זמין עבור microCT חיים הקטן (הרבה יותר גרוע ממה שזמין מסורקי אדם בגודל), סוכן ההדמיה הצליח לחפש ולסמן thrombi ידי הפיכתם hyperdense על CT, א 'סימן כלי צפוף "משופר על ידי מולקולרי הַדמָיָה.
משלימים את הטכניקה CT, הקבוצה שלנו בעבר פיתח טכניקת דימות פקיק ישירה אופטי באמצעות Cy5.5 פלורסנט האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) בדיקה לדמיין נטל פקיק מוחין 5. זוהי טכניקה vivo לשעבר על המוח פוסט מורטם, אבל הוא רגיש מאוד, ויש בהם כדי לאשר בנתונים vivo בסביבה המחקר.
בשניהם CT ו- NIRF מבוסס טכניקות הדמיה שוחרת פקיק מאפשר לנו להשוות לעומת טכניקות אלה כדי להשיג נתונים אינפורמטיבי מאוד על עצמו את התפקיד של פקיק והדמיה פקיק בתהליך של פיתוח שבץ איסכמי.
Here, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של טכניקה בשילוב של microCT in vivo לשעבר vivo NIRF הדמיה לדמיין thromboemboli ישירות במודל של עכברים לשבץ תסחיפים. שיטות פשוטות ויציבות אלה שימושיים כדי לקדם את הבנתנו מחל טרומבוטיים ידי ההפעלה המדויקת בהערכת vivo של פקיק ניטל / הפצה ואפיון של אבולוציה פקיק דינמית באופן מהיר וכמותיים in vivo במהלך טיפול, ואחריו נתוני vivo לשעבר המשמשים כסטנדרט מלא התייחסות לאישור של ממצאי הדמית in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפגנו את השימוש בשתי טכניקות הדמיה מולקולריות משלימות הדמית פקיק ישירה במודלים ניסיוניים לשבץ תסחיפים: א הפיברין ממוקד ננו-חלקיקים מזהב (FIB-GC-AuNP) בתחום הדמית vivo מבוסס microCT, וכן FXIIIa ממוקד חללית הדמיה אופטית עבור לשעבר vivo הדמיה ניאון.
<p class="jove_content" style=";tex…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי R טכנולוגיה בריאות קוריאה ופיתוח הפרויקט, משרד הבריאות והרווחה (HI12C1847, HI12C0066), תוכנית הפיתוח של טכנולוגיה ביו ורפואה (2,010-0,019,862) ו במעבדת המחקר העולמי (GRL) תוכנית (NRF-2015K1A1A2028228) של לאומי למחקר קרן, ממומנת על ידי ממשלת קוריאה.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
References
- Saver, J. L. Time is brain–quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T., Fisher, M. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. 92, 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
