Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Способ описан в котором квантовые точки (КТ) наночастицы могут быть использованы для корреляционного иммуноцитохимических исследований ткани патологии человека с использованием Widefield флуоресцентной световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Чтобы продемонстрировать протокол мы immunolabeled ультратонких эпоксидные участки опухоли соматостатинома человека с использованием первичных антител к соматостатин, с последующим биотинилированного вторичного антитела и визуализации стрептавидином, конъюгированного 585 нм кадмий-селен (CdSe) квантовых точек (КТ). Секции монтируются на образце сетки ПЭМ затем помещали на предметное стекло для наблюдения с помощью Widefield флуоресценции световой микроскопии. Световая микроскопия показывает 585 нм QD маркировке ярко-оранжевой флуоресценции, образуя зернистую картину внутри опухолевых клеток цитоплазмы. При низкой до середины диапазона увеличения с помощью световой микроскопии образец маркировки можно легко распознать и уровень неспецифической или фоновой маркировки оценены. Это критическийшаг для последующей интерпретации картины иммунноокрашивания методом просвечивающей электронной микроскопии и оценки морфологического контекста. В этом же разделе затем высушены и просмотрены с помощью ПЭМ. QD зонды видно быть прикреплены к аморфным материалом, содержащимся в отдельных секреторных гранул. Изображения получены из той же области интереса (ROI), видно с помощью световой микроскопии для корреляционного анализа. Соответствующие образы из каждой модальности могут затем быть смешаны для наложения данных флуоресценции на ТЕМ ультраструктуры соответствующего региона.
Introduction
Коррелятивное свето- и электронная микроскопия (CLEM) является мощным подходом для анализа переходных динамических событий 1, редких событий 2, 3 и 4 сложных систем. Есть много различных технических перестановками доступных 5 в зависимости от того , какой вопрос однако общим требованием является то , что та же самая структура , в одном образце 6 проецируется множественными модальностей микроскопии. Наш особый подход к CLEM был разработан для изучения архивных ткани патологии человека и при используемой здесь было хорошо охарактеризованы и опубликованы ранее 7. Цель состояла в том, во-первых, чтобы максимизировать аналитические данные из одного биопсии или хирургического образца и, во-вторых, использовать флуоресценцию световой микроскопии, чтобы помочь прояснить контекст Иммуноцитохимическую рисунка видно маркировки на ультраструктурном уровне.
Квантовая точка нанокристаллов (квантовых точек) предлагают потенциал системы ABL универсальный маркере , чтобы быть просмотрены как флуоресценцию световой микроскопии и электронной микроскопии 8, 9, 10. Их кристаллическая структура ядра позволяет квантовых точек разных размеров , чтобы генерировать широкий спектр пиков флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны вдали от их спектров испускания 11. Их атомный вес достаточно, чтобы получить плотность электронов, обнаруживаемых с помощью просвечивающей электронной микроскопии, сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM) или полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии. Они особенно подходят для иммуноцитохимических исследований, которые могут наблюдаться даже отдельные КТ дает предельную чувствительность одной QD на молекулы – мишени 12. Кроме того, в зависимости от QD используются они могут обладать индивидуальной элементарную подпись, подходящую для отображения.
Образцы патологии человека предлагают значительные преимущества для поступательной биомедицинских исследований. Хирургическая ткани и образцы биопсии обычно представляются на Biobanking и appropетел этики зазоры могут быть доступны для научных исследований. Человеческая ткань не имеют вопросы, имеющие отношение или интерпретации , которые могут произойти в животных или в пробирке моделях болезни. Тем не менее, подготовка образца образцов патологии часто не является оптимальным. Там может быть задержка в ткани помещаются в фиксаторе, неприемлемое закрепляющий использовали такие как формалин, а не для глутаральдегиду ТЭМ и неприемлемом выборки. Методы Клем имеют потенциал для оптимизации диагностики и прогностическую информацию доступной из одного человека образца. Тем не менее, некоторые недавно разработанные корреляционные подходы , такие как те , которые используют мини – генератор синглетного кислорода (miniSOG) не доступны для использования в патологии в связи с необходимостью для тега , чтобы быть генетически закодированы в клетку интереса 13. По этой причине мы исследовали полезность QD маркировки обычно подготовленной ТЕМ ткани для корреляционного иммуноцитохимических исследований. КТ применяется к гравированным эпоксидной или акриловой смолы секций из LiОбразцы ghtly альдегид фиксированные биопсии ткани и обеспечивают возможность получения соотносительную флуоресценции световой микроскопии и данные ПЭМ из одного образца.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование продемонстрировало потенциальную полезность в качестве универсальных квантовых точек зондов для исследования Клем. 585 нм наночастицы, используемые QD показали яркую и стабильную флуоресценцию при просмотре Widefield световой микроскопии и были легко наблюдать с помощью …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
