Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्वांटम डॉट नैनोकणों का उपयोग
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
एक विधि का वर्णन किया है जिसके तहत क्वांटम डॉट (G) नैनोकणों widefield प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) का उपयोग मानव विकृति ऊतक के correlative immunocytochemical अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल हम सोमेटोस्टैटिन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग मानव somatostatinoma ट्यूमर के Ultrathin epoxy वर्गों immunolabeled है, एक biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी और streptavidin संयुग्मित 585 एनएम कैडमियम सेलेनियम (सीडीएसई) क्वांटम डॉट्स (QDs) के साथ दृश्य से पीछा प्रदर्शित करने के लिए। वर्गों एक मंदिर नमूना ग्रिड तो widefield प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन के लिए एक गिलास स्लाइड पर रखा पर बढ़ रहे हैं। लाइट माइक्रोस्कोपी चमकीले नारंगी प्रतिदीप्ति ट्यूमर कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर एक बारीक पैटर्न बनाने के रूप में 585 एनएम QD लेबलिंग का पता चलता है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मध्य दूरी बढ़ाई कम से कम लेबलिंग पैटर्न को आसानी से पहचाना जा सकता है और गैर विशिष्ट या पृष्ठभूमि लेबलिंग के स्तर का आकलन किया। यह एक महत्वपूर्ण हैमंदिर से immunolabeling पैटर्न के बाद व्याख्या और रूपात्मक संदर्भ के मूल्यांकन के लिए कदम। एक ही अनुभाग तो सूखी मिट और मंदिर से देखा जाता है। QD जांच अनाकार व्यक्ति स्रावी कणिकाओं में निहित सामग्री से जुड़ी करते हुए देखा गया। छवियाँ ब्याज (आरओआई) के एक ही क्षेत्र correlative विश्लेषण के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा से अर्जित कर रहे हैं। प्रत्येक साधन से छवियों इसी फिर इसी क्षेत्र के मंदिर फैटी पर प्रतिदीप्ति डेटा ओवरले के लिए मिश्रित किया जा सकता है।
Introduction
Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्लेम) क्षणिक गतिशील घटनाओं 1, दुर्लभ घटनाओं 2, 3 और 4 जटिल प्रणालियों के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। कई अलग अलग तकनीकी क्रमपरिवर्तन उपलब्ध 5 सवाल के आधार पर कहा जा रहा है कर रहे हैं, लेकिन एक आम आवश्यकता है कि एक भी नमूना 6 में एक ही संरचना कई माइक्रोस्कोपी तौर तरीकों से ली जाती है। हमारा क्लेम करने के लिए विशेष दृष्टिकोण अभिलेखीय मानव विकृति के ऊतकों का अध्ययन और यहां इस्तेमाल अच्छी तरह से होती है और पहले प्रकाशित किया गया है 7 मामले के लिए विकसित किया गया था। उद्देश्य के लिए एक एकल बायोप्सी या शल्य नमूना और दूसरी से विश्लेषणात्मक डेटा को अधिकतम करने के लिए, प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के immunocytochemical लेबलिंग पैटर्न ultrastructural स्तर पर देखा के संदर्भ स्पष्ट करने में मदद करने के लिए सबसे पहले किया गया था।
क्वांटम डॉट nanocrystals (QDs) एक सार्वभौमिक मार्कर सिस्टम एबीएल की क्षमता प्रदान करते हैंई दोनों के द्वारा देखा जाना चाहिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 8, 9, 10। उनके क्रिस्टलीय मूल संरचना जब उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 11 से दूर तरंग दैर्ध्य प्रकाश से उत्साहित विभिन्न आकार के QDs प्रतिदीप्ति उत्सर्जन चोटियों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है। अपने परमाणु वजन इलेक्ट्रॉन घनत्व कि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) या क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable है उपज के लिए पर्याप्त है। वे विशेष रूप से immunocytochemical अध्ययन के लिए अनुकूल हैं के रूप में भी एकल QDs लक्ष्य अणु 12 प्रति एक QD की एक परम संवेदनशीलता देने के लिए मनाया जा सकता है। इसके अलावा, QD के आधार पर किया है कि वे एक व्यक्ति के मौलिक मानचित्रण के लिए उपयुक्त हस्ताक्षर अधिकारी कर सकते हैं।
मानव विकृति नमूने translational जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। सर्जिकल ऊतक और बायोप्सी नमूने नियमित रूप biobanking के लिए और approp के साथ प्रस्तुत कर रहे हैंriate नैतिकता मंजूरी अनुसंधान अध्ययन के लिए पहुँचा जा सकता है। मानव ऊतकों प्रासंगिकता या व्याख्या के मुद्दों है कि जानवर में या रोग के इन विट्रो मॉडल में हो सकता है नहीं है। हालांकि, विकृति विज्ञान के नमूनों का नमूना तैयार अक्सर इष्टतम नहीं है। ऊतक में देरी लगानेवाला में रखा जा रहा है हो सकता है, अनुचित लगानेवाला ऐसे glutaraldehyde formalin बजाय मंदिर और अनुचित नमूना लेने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया। भूखों मरना तरीकों नैदानिक और शकुन जानकारी एक ही मानव नमूना से उपलब्ध अनुकूलन करने की क्षमता है। हालांकि, इस तरह के रोजगार मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर (miniSOG) उन के रूप में कुछ नव विकसित correlative दृष्टिकोण के लिए टैग आनुवंशिक रूप से ब्याज 13 की सेल में इनकोडिंग जा करने के लिए की आवश्यकता के कारण विकृति में उपयोग के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इस कारण से हम correlative immunocytochemical अध्ययन के लिए नियमित रूप से तैयार मंदिर ऊतक के QD लेबलिंग की उपयोगिता का पता लगाया है। QDs नक्काशी epoxy या ली से ऐक्रेलिक राल वर्गों के लिए लागूghtly एल्डिहाइड तय बायोप्सी और ऊतकों के नमूनों एक भी नमूना से correlative प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी और मंदिर डेटा प्राप्त करने की संभावना प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन भूखों मरना अध्ययन के लिए सार्वभौमिक जांच के रूप में QDs की क्षमता उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। 585 एनएम QD इस्तेमाल किया नैनोकणों जब widefield प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी और तत्काल मंदिर से मनाय?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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