Summary
我们描述的体外协议共同培养肠道微生物和小肠绒毛为使用人肠道上的单芯片microphysiological系统长时间。
Abstract
在这里,我们描述进行多品种的长期合作,培养人肠道微生物与人体肠道的单芯片器件microphysiological微工程小肠绒毛的协议。我们概括在一个微流体装置,其中,生理机械变形和流体剪切流动不断施加到模仿蠕动肠腔毛细管组织界面。在管腔微通道,人肠上皮细胞的Caco-2细胞进行培养,以形成一个“无菌”绒毛上皮和再生小肠绒毛。预培养的微生物细胞接种到腔侧建立主机的微生物生态系统。后的微生物细胞附着在绒毛的顶端表面,流体流动和机械变形被恢复,以产生一个稳定状态的微环境,其中新鲜培养基不断地供给和未结合的细菌(以及细菌废物)被连续除去。扩展共培养˚F后罗天至数周,找到多个小菌落被随机定位的绒毛之间,并且两者的微生物细胞和上皮细胞保持存活和功能的至少一个星期培养。我们的共培养协议可以适于提供用于可在各种人体器官中找到其他宿主微生物生态系统,其可在人的微生物组中编排健康和疾病中的作用的体外研究促进通用平台。
Introduction
人体肠道窝藏微生物物种的一个惊人的多样化(<1000种)和微生物细胞的巨大数目(比人类宿主细胞的10倍)和基因(除人类基因组的100倍)1。这些人类微生物组起到代谢营养物和外源物,调节免疫应答,和维持肠稳态2关键作用。毫不奇怪,由于这些不同的功能,共生的肠道微生物广泛调节健康与疾病3。因此,了解肠道微生物与宿主-微生物相互作用的作用是非常重要的促胃肠(GI)的健康和探索新的治疗肠道疾病4。但是,现有的体外肠模型( 例如,静态培养物)限制宿主微生物共培养到的短时间(<1天),因为微生物细胞长满 和妥协肠屏障功能5。替代动物模型( 例如,无菌的6或遗传工程小鼠7)也不会通常用于研究宿主肠道微生物串扰,因为殖民化和人类肠道微生物稳定维持都很难。
为了克服这些挑战,我们最近开发出一种仿生人“的肠道上一个芯片”microphysiological系统( 图1A,左)模拟发生在生活人体肠道5,8主机肠道微生物的相互作用。肠道上的单芯片微型包含由柔性,多孔,细胞外基质(ECM)涂覆的膜通过人类肠上皮Caco-2细胞内衬,模仿肠腔毛细管组织界面( 图1A分开的两个平行的微流体通道,吧)9。真空驱动的周期性节奏的变形引起的生理机械变形模仿的变化通常INDUC通过蠕动( 图1A,右图)主编。有趣的是,当Caco-2细胞在肠上的单芯片多100小时生长,它们自发地形成三维(3D)小肠绒毛与紧密连接,顶端刷状缘,不限于基底隐窝增殖性细胞,粘液产生,增加的药物代谢活性( 例如,细胞色素P450 3A4,CYP3A4),和增强的葡萄糖再摄取8。在这种“无菌”微环境,这是可能的共同培养的益生菌鼠李糖乳杆菌 GG或长达两周5,10-治疗地层与宿主上皮细胞益生菌细菌的混合物。
在这项研究中,我们描述了详细的协议,以在肠上的单芯片设备执行主机肠道微生物共培养延长的时间。此外,我们讨论的关键问题和潜在的挑战,要考虑这个主机微生物共培养p的广阔的应用rotocol。
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Protocol
1.肠道的单芯片器件的微细加工
注意:肠道上的单芯片是由透明的,透气的聚硅氧烷聚合物(聚二甲基硅氧烷,PDMS)制成的微流体器件,包含由柔性分隔的两个平行微通道(1毫米宽×150微米的高度×1厘米长)多孔(10微米孔径,25微米间距的孔到孔)PDMS膜5,9。制造肠道上的单芯片( 图1A,左)以下提供的步骤。
- 在肠道上的单芯片5,9的微细加工过程。
- 通过混合的PDMS预聚物和固化剂的制备未固化的,脱气的PDMS(15:1重量/重量),并且将其放置在真空干燥器30分钟。
- 倾30克和3克未固化的,脱气的PDMS上具有上部的SU-8基于微图案和肠道上的单芯片的下微通道,分别各硅模具。然后在60℃的干燥烘箱中固化为L东四小时。
- 通过使用外科手术刀周围边缘切割脱模从各硅模具的上部和下部的PDMS层。冲床用活检冲床(2.0毫米孔径)6孔(两个进口,两个出口和两个真空室)。
- 通过含有交阵列与平面重叠圆形支柱(10微米的直径,在高度为25μm)硅烷化的硅晶片上浇注10克未固化的和脱气的PDMS制备多孔膜,硅烷化的PDMS支撑层(15:1,W / W; 1厘米厚)。放置在设定为3公斤的重量压并在60℃下固化该聚合物12小时或更长的时间。
- 脱模通过仔细举起从晶片板坯的角部,和剥离,直至多孔PDMS膜被完全从晶片脱离粘附到从硅晶片的PDMS支承板坯的多孔PDMS膜的设置。
- 露出的上部层的沟道侧(PDMS,15:1,W / W)和多孔膜侧到复由一手持电晕产生阿斯马贾为分别为1分钟,3秒。
- 通过将并联每一块无任何气泡放置在一个共形接触的多孔PDMS膜和上微通道层的等离子体处理的表面。
- 孵育80°CO / N整个安装两个PDMS层的粘接不可逆转。
- 通过仔细地抬起支承层的角部,和剥离,直到支撑层完全从与膜的上层脱落剥离从与多孔膜的上层的组装与PDMS支撑层。
- 撕下这张膜位于比用细尖镊子,使空心真空室真空室(位于主通道两侧的两个腔室)的部分。
- 暴露附着在顶片和与刻在下部片以相同的方式在等离子体通道的一侧的膜的一侧所描述我n阶1.1.6 1分钟。
- 通过将并联每一块未经立体镜之下的任何气泡对准的多孔膜的上微通道层和下部层用共形接触。
- 固化在干燥炉中的整个设置在80℃CO / N以产生含有旁边的微流体单元沟道两个中空真空腔室的完整规模肠道上的单芯片微流体装置。
- 通过一个90°的弯曲不锈钢钝端针连接管将连接到上部或下部微通道在肠上的单芯片每个端口的入口和出口。
- 连接管连接到连接于使用一90°的弯曲不锈钢钝端针头的真空室中的孔。
- 由流用1毫升灭菌的一次性注射器70%(V / V)乙醇消毒微通道和管道。
- 干出在60℃的烘箱O / N微通道和管道。
2.微引擎的增长ERED肠绒毛在肠道上的单芯片器件
- 种子肠上皮细胞( 如 :的Caco-2BBE)上的肠上的单芯片微型5,9。
- 消毒装置,用70%(V / V)乙醇(参见步骤1.4),使用1毫升灭菌的一次性注射器,随后在60℃干燥烘箱õ干燥/ N(步骤1.5)之前的表面活化。
- 暴露肠道上的单芯片微系统的完整的设置( 即,一体的肠上的单芯片连接于管)于UV光(253.7纳米)和臭氧同时40分钟。
- 冷静下来RT在该设备用于在生物安全柜(BSC)在UV光下15分钟。
- 引入100微升的ECM涂覆的溶液 - 50微克/毫升的I型胶原并在无血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释300微克/毫升的细胞外基质混合物的混合物 - 使用一次性成上下两个微通道无菌1ml注射器。
- Incuba忒整个设置在37℃,湿度5%, 二氧化碳培养箱1小时。
- 德加50毫升的预热(37℃)完全培养基(DMEM,20%,体积/体积,胎牛血清(FBS),100单位/ ml青霉素和100微克/毫升链霉素;在一个3毫升的等分一次性注射器),使用在BSC 50毫升过滤系统(0.45微米孔径)为1分钟。
- 通过过滤系统通过预热介质和过滤介质上轻轻拍打1分钟以除去培养基中的任何气泡或溶解的气体。
- 放置脱气完全培养基的等分试样在3mL的一次性注射器和孵育在37℃潮湿的5%CO 2的培养箱中培养1小时。
- 连接含有脱气23毫升一次性注射器,预热的完全培养基中的上和下微通道。
- 使用注射泵在体积流动的脱气完整细胞培养基进入上部微通道在37℃流30微升/小时的速率(相当于剪切应力以0.02达因/ cm 2)的加湿5%CO 2培养箱O / N。
- 在肠道上的单芯片微工程的Caco-2绒毛的形成。
- 使用的Caco-2BBE细胞用50和65之间的通道数目。
- 生长的Caco-2细胞在含有完全培养基在37℃的T75烧瓶加湿5%CO 2的培养箱中4-5天,以获得充分融合细胞。
- 加入10 mL 的 Ca 2+和Mg 2+ -free PBS充分在T75烧瓶中生长汇合Caco-2细胞,洗涤细胞,然后吸出PBS中。重复此步骤两次。
- 加入1ml 0.05%胰蛋白酶/ EDTA溶液孵育在37℃潮湿的5%CO 2培养箱5分钟。
- 通过上下吹打三至五倍重悬离解的细胞用10ml预热完全细胞培养基(含FBS)。
- 降速C语言对细胞悬液entrifugation在500 XG 5分钟,然后取出上清。
- 悬浮再次用1ml预热完全培养基在器件〜1.5×10 5个细胞/ cm 2至调整细胞密度。使用血细胞计数器估算细胞密度。
- 通过将附着于连接到上部微通道管的出口25的G5 / 8针1毫升一次性注射器注入100微升重新悬浮的Caco-2细胞进入上部微通道(内腔侧)。
- 钳连接到用长尾夹在上下微通道的所有入口和管道的出口。
- 孵育在37℃,湿润的5%CO 2培养箱整个设置1小时,以允许解离Caco-2细胞附着在多孔膜的表面上。
- 除去夹具和使用注射泵,直至细胞形成24-36小时完整单层恢复培养基的流动仅在30微升/小时的上微通道。使用阶段反政府T或微分干涉对比(DIC)显微镜来确认在细胞单层细胞 - 细胞连接。
- 当细胞形成单层,灌注在30微升/小时的相同的流速培养基成两个上(腔)和下(毛细管)微通道。
- 机械变形模仿蠕动状运动5,9中的应用。
- 打开装有张力设备的真空泵。
- 通过管道用不锈钢接头连接真空室与真空控制器。
- 设置10%的平均细胞株的伸展运动在0.15赫兹与真空控制软件循环正弦函数模式的频率,然后单击“开始”。
- 维持培养基的两个上和下微通道下机械变形为〜100小时的恒定流量(30微升/小时)至汇合的Caco-2单层(10%,0.15赫兹)。
注意:Caco-2细胞SPONtaneously经历与波纹三维凸起延伸朝向上皮微通道5,8-10的内腔绒毛形态。
- 与在肠上的单芯片10流明毛细管组织界面模拟人体活肠的器官级的功能,按照步骤如上所述。
- 重复步骤2.1至2.2微工程增长的Caco-2绒毛。
- 流的预热共培养培养基(完整的Caco-2细胞培养基和完整HMVECs培养基的混合物,1:1体积/体积)在30微升/小时的上下微通道。
- 引入100微升解离的正常人毛细血管微血管内皮细胞(HMVECs;最终细胞密度,〜5.0×10 5个细胞/ cm 2)到由在步骤从2.2.3至2.2.9中描述的相同方法下微通道。
- 放置固化矩形的PDMS片(0.5厘米×1厘米×1厘米;宽×长度×高度; 15:1,W/ w的弹性体:固化剂)在肠道上的单芯片器件的顶部,然后翻转整个设备设置倒挂( 即上微面临的下行,下微面临上档)。
- 孵育在37℃,湿润的5%CO 2培养箱设置为1小时,以允许解离HMVECs附着在下部微多孔膜的表面上。
- 取出从二氧化碳培养箱整体设置,并翻转安装一遍。
- 流预热共培养培养基(完整的Caco-2细胞培养基和完整HMVECs培养基的混合物,1:1体积/体积)为在30微升/小时以机械拉伸运动上下两个微通道( 10%,0.15 Hz),并且至少三天以形成内皮细胞单层的细胞 - 细胞连接。
3.主机肠道微生物共培养在肠道上的单芯片微型
- 执行预培养ØF中的细菌细胞如下的微工程小肠绒毛共同培养共生肠道微生物。
- 重悬在10ml的混合物的冷冻干燥益生菌粉末混合物:高压灭菌乳酸菌MRS肉汤和钢筋梭菌培养基(1:1,V / V)。
- 通过在10ml的一次性无菌管中添加介质的适量,然后等分3毫升微生物细胞悬浮液调整最终细胞密度约为0.2光密度单位(在600nm)。
- 含有悬浮的微生物细胞在厌氧容器地方管。添加厌氧气体生成小袋的两个包在容器中。紧紧关闭容器盖和孵化容器设置而没在37℃下振荡加湿5% 二氧化碳培养箱O / N。
- 微生物组和共培养肠上皮细胞5,10接种。
- 准备包含脱气antibioti3毫升一次性注射器的c-无细胞培养基( 即,DMEM,用20%FBS)中。对于培养液的脱气过程见2.1.6。
- 取出从二氧化碳培养箱含微工程绒毛肠道的单芯片器件的整体设置,然后进入到生物安全柜。
- 移除连接到管道连接到上部和下部微注射器。连接3.2.1准备设备注射器,带回的二氧化碳培养箱,那么这种流动不含抗生素的培养基中培养12小时微生物播种之前。
- 降速预培养的益生菌细菌混合物的细胞(见3.1的步骤)以10,000 xg离心5分钟。吸出使用真空上清,然后重悬在无抗生素的DMEM培养基中(终细胞密度,〜1.0×10 7 CFU / ml)中。
- 注入细胞悬液到使用连接到25 1毫升一次性注射器含有“无菌”肠绒毛的微通道的内腔侧G5 / 8针。允许微生物细胞的肠绒毛的顶端表面的粘附为〜而不流1.5小时通过夹紧到所有管端。
- 灌注预热无抗生素培养基成上下两个微通道,在40微升/小时与环状节奏变形(10%,0.15赫兹)。
- 绿色荧光蛋白的共培养(GFP)标记的大肠杆菌大肠杆菌 (GFP 大肠杆菌 ;非致病性DH5-α- 大肠杆菌宿主)-10,11-细胞用微工程绒毛,预培养的GFP E.大肠杆菌细胞中,在37℃下12小时振荡条件(200rpm)下蒸压LB培养基。重复该过程从3.2.5至3.2.6进行GFP 大肠杆菌的共培养大肠杆菌细胞与微工程绒毛。
- 细胞图像5,8-10
- 记录微生物和上皮形态5,8,10执行DIC,萤光,或激光扫描共聚焦显微镜。
- 对于DIC成像,取出肠的单芯片微系统的设置从二氧化碳培养箱,将设备安装在显微镜的阶段,然后记录细胞形态。
- 对于绒毛上皮荧光成像,流PBS中洗涤,在100微升/小时的细胞10分钟。
- 固定绒毛用4%(重量/体积)低聚甲醛15分钟。然后流PBS中洗涤,在100微升/小时的细胞10分钟。
- 用0.3%的透化绒毛(体积/体积)的Triton X-100稀释在含有PBS中2%(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)10分钟。然后流PBS中洗涤,在100微升/小时的细胞10分钟。
- 块的细胞,用2%(重量/体积)1小时的PBS BSA溶液。然后流PBS中洗涤,在100微升/小时的细胞10分钟。
- 添加300nM的4',6-二脒基-2-苯基二盐酸盐(DAPI)溶液在PBS中稀释为下光保护的核染色。
- 添加25单位/毫升荧光鬼笔的(鬼笔环肽-CF647共轭)溶解在PBS的F-肌动蛋白染色光下的保护。
- 使用激光扫描共聚焦显微镜荧光染色的细胞图像记录。
注:25X的目标是在激光共聚焦显微镜在适当的光学变焦应用。在图3B中,使用约525X放大倍数。
- 记录微生物和上皮形态5,8,10执行DIC,萤光,或激光扫描共聚焦显微镜。
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Representative Results
为了模拟在体外人体肠道主机微生物生态系统,它是 必要开发一种实验协议来重建的生理条件,例如蠕动状力学和流体流动下肠道细菌和人肠上皮细胞的长期稳定的共培养。这里,我们利用仿生肠道上的单芯片微型 ( 图1A)共同培养生活在直接接触的微生物细胞用活的人体绒毛为或体外周的周期以上。在肠上皮细胞中自发地形成分化良好绒毛时在生理学相关的流体流动和循环机械变形5的存在下,2通道的微流体装置的一个通道的多孔的ECM涂覆的膜的一侧进行培养。该微工程绒毛复制人体小肠绒毛,包括formati的结构和功能由心尖刷状缘内衬柱状上皮细胞,基底增生隐窝与移民和女儿细胞隐窝至绒毛尖,高水平的粘液产量,加强药物的代谢活性,并增加葡萄糖摄取8的进展的分化。活的内皮细胞可以在相同的膜的相反侧进行培养,以重新创建肠壁的组织-组织界面,和免疫细胞可以在系统中培养,以及10。为了验证肠上皮细胞,形成在肠上的单芯片肠绒毛的紧密连接屏障的保护功能被间歇通过测量跨上皮电阻(TEER)5,10,12定量。 TEER值常规监测来估计在每一个关口一个细胞单层或肠绒毛的完整性要求( 例如,之前加入细菌进入流明)。
7 CFU / ml)的被接种到上皮微通道的内腔( 图1B,“接种”)。后的微生物细胞附着绒毛的顶端表面上在没有流量为〜1.5小时( 图1B,“附件”),生理流动(40微升/小时)是通过与环状机械变形两个通道恢复(在10%应变0.15赫兹),以除去未结合的肠道细菌和供应营养,细菌和绒毛上皮细胞( 图1B,“共同文化”)。此共培养协议允许在intervillus空间益生菌多个物种的稳定定植,与被保持在共培养长达两周( 图2A,2B)的活细菌菌落。在这项研究中,共mmercial益生菌制剂,其中包含8个不同的兼性或专性厌氧菌的混合群, 短双歧杆菌 ,B的益生菌菌株茇 ,B.婴儿 , 嗜酸乳杆菌 ,L。植物 ,L.副干酪乳杆菌 ,L。保加利亚 ,和链球菌嗜热被使用。
此共培养方法可以广泛应用,以模拟人类的肠宿主微生物生态系统。例如,非致病性的GFP E.大肠杆菌可以共培养在肠上的单芯片器件生长肠绒毛的表面上。基于相同的协议如上所述,附着的GFP E.大肠杆菌对绒毛细胞的单细胞在1小时增长到3天在intervillus空间定位( 图3B,1小时与72小时)时,下滴培养多菌落( 图3A,1小时与72小时)流(40微升/小时)在蠕动状变形的存在下(10%,0.15赫兹)。
图1. 人体肠道上级芯片为宿主肠道微生物共培养microphysiological系统 (A)的照片(左)和2通道的示意图(右),肠道上的单芯片微流体装置。箭头指示培养基流动的方向(蓝色,顶端微通道;红色,底部微通道)。 (B)的宿主-肠道微生物共培养在肠道上的单芯片的步骤的示意图。后肠上皮细胞形成绒毛(〜100小时),再悬浮于细胞培养基中的微生物细胞被引入到内腔微通道(接种),则培养基的流动被暂停〜1.5小时(备注)。后的微生物细胞附着在小肠绒毛的顶端表面,流量被恢复(联合 -文化)。 请点击此处查看该图的放大版本。
多个益生菌在肠道上的单芯片肠绒毛的 图2 共培养。(A)微分干涉对比显微照片显示益生菌细菌细胞在肠道芯片的绒毛之间生长的小菌落。 (B)A的高功率放大视图(黑色虚线正方形),显示益生菌细菌细胞的菌落(红色箭头)。 V,绒毛;比例尺= 20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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非致病的,GFP标记 E 的 图3 共培养在1和72小时采取的大肠杆菌 在肠道上的单芯片小肠绒毛。(A),它覆盖荧光和DIC显微图像,显示绿色荧光蛋白E.殖民大肠杆菌在肠道上的单芯片生长的小肠绒毛。 (B)在1和72小时取叠加荧光共焦显微照片的高功率放大视图表示GFP标记大肠杆菌的生长大肠杆菌从单细胞(红色箭头)以小菌落(白色箭头)。蓝色,核;品红,F-肌动蛋白;比例尺= 30微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
了解主机微生物的相互作用,是推进医药至关重要的;然而,在一个塑料盘或静态孔板进行传统的细胞培养模型不支持人肠细胞的稳定共培养与活肠道微生物超过1-2天,因为微生物细胞大多长满哺乳动物细胞在体外 。的过度生长的微生物数量迅速消耗氧气和营养物,随后产生代谢废物( 例如,有机酸),其严重危及肠屏障功能和引起肠上皮细胞死亡的量过多。因此,防止了导致营养物耗尽的微生物过度生长和微生物废物的累积是在共培养微环境维持可行的宿主微生物共存较长时间内(从几天到几周)是至关重要的。
为了克服这些挑战,一个microphysiological肠道上的单芯片器件-5,8-已开发,以形成完全分化的人肠绒毛和保持体外肠腔的稳态的微环境。的设计和功能单元( 例如,微流体流动池室中,真空驱动的环状的变形)一个肠上的单芯片微流体装置被修改,以精确地模拟生理,物理和化学的微环境对微生物共培养5, 10。在肠上的单芯片微流体培养所施加的剪切应力通过在人体肠道5,13管腔流的生理范围来确定。对于主机 - 微生物联合培养,保持肠道上单芯片的管腔微微生物种群的“稳态”是在支持化学和营养条件可行的关键。在肠上的单芯片微系统,有可能估计在帧内管腔稳态肠道上的单芯片由measuri纳克培养基和微生物细胞密度的pH。因为新鲜培养基连续地流经微通道,当微生物细胞的初始接种密度和培养介质的体积流率进行了优化两者的微生物细胞和上皮细胞不发生营养耗竭。穿过微通道中的条件培养基在限定的体积流速(在此,40微升/小时),因此,代谢废物( 例如,有机酸)以及蜂窝secretomes( 例如,细胞因子)被连续从共除去流出文化的微环境。因此,肠 - 上的单芯片装置可以被认为是一个“连续反应器”具有必要和足够的从肠道微通道的内腔能有效洗出未结合的或杂草丛生的微生物细胞稳态的微环境,这有利于产生在2-3天内稳定的微生物利基。
还有关键的发必须考虑故障排除微生物细胞对小肠绒毛的成功合作培养构建函数。首先,有必要确定附加到绒毛的表面,因为微生物粘附可以微生物物种之间变化所需的微生物细胞的优化的温育时间。例如,益生细菌,例如鼠李糖乳杆菌 GG 5,一般需要〜1.0-1.5小时附着,但其他一些微生物物种,可能需要更短( 例如,病原性微生物)或更长的时间,这取决于它们的粘附动力学14。第二,该微生物细胞的初始接种密度应该被识别,因为过多的微生物细胞数可导致细菌的共培养的早期阶段的产物,其可以以稳定的稳态的实现干扰。优化此接种密度,建议以表征在antibi靶微生物菌株的生长轮廓在不同的接种密度无耳部的细胞培养基。最后,可以根据微生物物种所需的体积流速的调节。例如,如果微生物细胞增殖非常迅速增加的流动速率是必需的。据实验证实,流速率高达300微升/小时(0.2达因/厘米2)不损害屏障功能和微工程绒毛细胞形态(数据未显示)。虽然鼠李糖乳杆菌 GG 5,过度的计数器益生菌混合物,VSL#3,非致病性的实验室菌株大肠杆菌大肠杆菌以及致病肠侵袭性大肠杆菌大肠杆菌菌株10被成功地应用在肠上的单芯片长期共培养,它仍然需要测试各种从共 生肠道菌群对病原感染性微生物的微生物物种。 体外微生物细胞的培养力应在存在或不存在可以考虑在共生演化的背景下,在培养不可培养的肠道微生物的测试是一个有趣的挑战宿主细胞。最后,在肠上的单芯片好氧和厌氧微生物的共培养一个强大的协议是一个关键的未满足的需要在未来被发现。
有,可以采取进一步提高模型的步骤,如使用主要肠上皮或从谁具有特定胃肠道疾病如Crohn氏病或结肠直肠癌个体人类受试者未分化的干细胞的;或诱导的多能干细胞(iPS细胞)。但是,在编排人类健康和疾病中人类微生物的作用新兴兴趣,我们的宿主微生物共培养方法已产生巨大的意义和潜在的应用到模仿在人体中发现的其他主机微生物生态系统( 如,口腔15,16皮肤,泌尿生殖系统或ŤRACT 17)。最后,该共培养方法可以通过改进的可预见性如何的生物利用度,效能和新的药物化合物的毒性的肠道微生物影响方面创新常规药物开发过程。两者合计,肠 - 上的单芯片microphysiological系统可以提供一个稳定的平台,以建立稳定的稳态肠微环境,可用于重构宿主微生物生态系统。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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