Summary
私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。
Abstract
ここでは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalデバイスにおけるマイクロ加工腸絨毛を有する多種のヒト腸microbiomeの長期共培養を行うためのプロトコルを記述します。私たちは、生理的機械的変形と流体せん断流れは絶えず蠕動運動を模倣するために適用されるマイクロ流体デバイス、内腸管腔毛細血管組織界面を再現します。ルーメンマイクロチャネルにおいて、ヒト腸上皮のCaco-2細胞は、「無菌」絨毛上皮を形成し、小腸絨毛を再生する培養されます。前培養した微生物細胞は、宿主微生物の生態系を確立するために、ルーメン側に接種します。微生物細胞は、絨毛の先端面に付着した後、流体の流れ及び機械的変形は、新鮮な培養培地を常時供給して未結合細菌(ならびに細菌性廃棄物)である定常状態の微小環境を生成するために再開される連続的に除去されます。拡張された共培養Fの後ROM日週に、複数の微小コロニーを無作為に絨毛の間に位置することが見出されており、両方の微生物および上皮細胞は、培養中で少なくとも1週間生存し、機能しています。私たちの共培養プロトコルは、健康と病気を組織内の人間microbiomeの役割のin vitroでの研究に容易にすることができる様々なヒトの臓器、中に見出すことができる他のホストmicrobiome生態系のための汎用プラットフォームを提供するように適合させることができます。
Introduction
ヒトの腸は、微生物種の驚くほど多様な配列(<千種)と驚異的な微生物細胞の数(ヒト宿主細胞よりも10倍以上)と遺伝子(ヒトゲノムよりも100倍以上)の1を保有します。これらのヒトmicrobiomesは、栄養素および生体異物を代謝免疫応答を調節し、腸のホメオスタシス2を維持する上で重要な役割を果たしています。驚くべきことではないが、これらの多様な機能を考えると、共生腸microbiomeは広く健康と病気3を変調します 。したがって、腸のmicrobiomeとホスト微生物の相互作用の役割を理解することは、胃腸(GI)の健康を促進し、腸の障害4のための新しい治療法を探求するために非常に重要です。しかし、 インビトロでの腸モデル( 例えば、静置培養) 中に存在するのは時間の短い期間(<1日)微生物細胞が過剰に増殖し、腸の障壁を損なうためにホストmicrobiome共培養を制限します機能5。植民地と人間の腸microbiomeの安定維持が困難であるため、代理動物モデル( 例えば、無菌6または遺伝子操作マウス7)はまた、一般的にホスト腸microbiomeのクロストークを研究するために使用されていません。
これらの課題を克服するために、我々は最近、生きているヒトの腸5,8で発生したホスト腸microbiome相互作用をエミュレートする「ガット・オン・チップ」microphysiologicalシステム(左図1A)バイオミメティック人間を開発しました。腸オンチップマイクロデバイスは、柔軟な、多孔質、細胞外マトリックス(ECM)は、ヒトの腸上皮のCaco-2細胞が並んでコーティングされた膜、腸管腔毛細血管組織界面( 図1Aを模倣することによって分離された2つの並列マイクロ流体チャネルが含まれています、右)9。真空駆動型の環状リズミカルな変形は通常induc変更を模倣する生理学的な機械的変形を誘発します(右図1A)蠕動運動によって編。興味深いことに、のCaco-2細胞は、100以上の時間のための腸オンチップで栽培されたとき、彼らは自然にタイトジャンクション、頂端ブラシの境界線、基底陰窩に限定増殖性細胞と3次元(3D)腸絨毛を形成し、粘液産生は、薬物代謝活性( 例えば、シトクロムP450 3A4、CYP3A4)、および強化されたグルコースの再取り込み8を増加させました 。この「無菌」微小環境では、プロバイオティクスラクトバチルス・ラムノサス GGまたは2週間まで5,10のための宿主上皮細胞とプロバイオティクス細菌の混合物の治療上の形成がする共培養が可能でした。
本研究では、長期間腸オンチップデバイスでホスト腸microbiome共培養を実行するための詳細なプロトコルを記述します。加えて、我々はこのホスト-microbiome共培養Pの広範なアプリケーションのために考慮すべき重要な問題と潜在的な課題を議論しますrotocol。
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Protocol
ガット・オン・チップデバイスの1微細加工
注:ガット・オン・チップは、透明、ガス透過性シリコーンポリマー(ポリジメチルシロキサン、PDMS)製のマイクロ流体デバイスである、二つの平行なマイクロチャネルを含む(1ミリメートル幅×150μmの高さ×1センチ長さ)柔軟で区切ら多孔性(細孔径が10μm、気孔する細孔間隔で25ミクロン)PDMS膜5,9。提供の手順以下の腸・オン・チップ(左図1A)を製造します。
- ガット・オン・チップ5,9の微細加工手順。
- PDMSプレポリマーと硬化剤と混合することにより、未硬化、脱気したPDMSを準備します(15:w / wの1)を、30分間真空デシケーターに入れてください。
- 30グラムと未硬化の3グラムを注ぎ、SU-8、上部のベースマイクロパターンおよび腸・オン・チップ、それぞれの低いマイクロチャネルを持つ各シリコン型にPDMSを脱気しました。次にlのドライオーブン中で60℃で硬化東4時間。
- 外科用メスを用いてエッジの周りに切断することにより、各シリコン鋳型から上下のPDMS層をデモールド。生検パンチャー(穴の直径2.0ミリメートル)を使用して、6穴(2つの入口、二つの出口、および2つの真空チャンバー)をパンチ。
- 未硬化の10グラムを注ぐことにより、多孔質膜を準備し、円形の柱と柱の配列を含むシラン化シリコンウェハ上にPDMSを脱気(直径が10μm、高さ25μmの)フラットで重ね、PDMS支持層(15シラン化:ワット1を、 /ワット;厚さ1cm)。セットアップに3キロの重量押えを置き、12時間以上60℃でポリマーを硬化させます。
- 慎重にウエハからスラブの隅を持ち上げて、シリコンウエハからPDMS支持スラブに付着した多孔質PDMS膜のセットアップを脱型し、多孔質PDMS膜が完全にウェハから切り離されるまで剥離。
- PLに多孔質膜側:上位層(1、w / wのPDMS、15)のチャネル側を公開asmaがそれぞれ1分、3秒、のために携帯型コロナ処理機によって生成されます。
- 気泡なしで並列に各ピースを配置することによって多孔質PDMS膜と共形接触の上位マイクロチャネル層のプラズマ処理表面を置きます。
- 2 PDMS層の不可逆的な結合のために80℃のCO / Nで全体のセットアップをインキュベートします。
- 慎重支持層の隅を持ち上げて、支持層が完全に膜と上層から取り外されるまで剥離することにより、多孔質膜と上層のアセンブリからPDMS支持層をはがし。
- 中空真空チャンバを作るために、微細先端ピンセットを用いて真空チャンバ(メインチャンネルのいずれかの側に位置する2つの室)の上に配置この膜の部分を切り取り。
- 私が説明したように、トップピースと同じように、プラズマに下片に刻まれたチャンネルの側に取り付けられた膜と側面を公開nは1分間1.1.6ステップ。
- ステレオスコープの下で気泡なしで並列に各ピースを配置することにより、共形接触を有する多孔質膜を有する上部マイクロチャネル層と下層を合わせます。
- マイクロ流体セルチャネルの横に2つの中空の真空チャンバを含む完全なスケール腸オンチップマイクロ流体デバイスを製造するために80℃のCO / Nで乾燥オーブンで全体のセットアップを治します。
- 90°曲がったステンレス鋼の平滑末端針を介して腸オンチップで下限またはマイクロチャンネルにリンクされている各ポートの入口と出口にチューブを接続します。
- 90°曲がったステンレス鋼平滑末端針を用いて真空チャンバに連結された穴にチューブを接続します。
- 使い捨て注射器を滅菌を1ml用いて70%(v / v)エタノールを流すことによってマイクロチャネルおよびチューブを滅菌します。
- 60℃のドライオーブンO / Nでのマイクロチャネルおよびチューブを乾かします。
マイクロエンジンの2.成長ガット・オン・チップデバイスでered腸絨毛
- ガット・オン・チップマイクロデバイスの5,9上にシード腸上皮細胞( 例えばのCaco-2BBE)。
- 前の表面活性化を60℃の乾燥オーブンO / N(ステップ1.5参照)で乾燥した1 mlの滅菌使い捨て注射器を使用して(ステップ1.4参照)、70%(v / v)エタノールを用いて装置を滅菌します。
- 腸オンチップマイクロシステムの完全なセットアップを公開( すなわち、本体腸オンチップチューブに接続されている)を同時に40分間UV光(波長253.7nm)及びオゾンへ。
- 安全キャビネット(BSC)にUV光の下で15分間、RTでデバイスをクールダウン。
- 使い捨てを使用して、上下のマイクロチャネルの両方に - 私はコラーゲンを50μg/ mlのタイプ、無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に希釈した300 / mlの細胞外マトリックス混合物の混合溶液 - ECMコーティングの100μLを紹介滅菌1mlシリンジ。
- Incuba37°Cで全体のセットアップTE 1時間、5%CO 2インキュベーターを加湿。
- ドガ予め温めた(37℃)の完全培地(DMEM、20%v / vウシ胎児血清(FBS)、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを50ml、3mlに等分1分間BSCで50mLのろ過装置(孔径0.45μm)を用いて、使い捨て注射器)。
- ろ過システムを介して予め温めた培地をパスし、培地中の気泡や溶存ガスを除去するために、1分間のろ過媒体に軽くタップします。
- 3ミリリットル使い捨て注射器に脱気した完全培地のアリコートを置き、37℃でインキュベート1時間、5%CO 2インキュベーターを加湿。
- 2 3ミリリットルを上下のマイクロチャネルに脱気し、予め温めておいた完全培養培地を含む使い捨て注射器を接続します。
- 容積で、シリンジポンプを使用して、上部マイクロチャネルに脱気し、完全な細胞培養液を流します37°Cで(0.02ダイン/ cm 2での剪断応力に相当)を30μl/ hrの流量は、5%CO 2インキュベータO / Nを加湿しました。
- ガット・オン・チップにおけるマイクロ加工のCaco-2絨毛の形成。
- 50と65の間の通路番号でのCaco-2BBE細胞を使用してください。
- 37°Cで完全培養培地を含むT75フラスコ中で成長したCaco-2細胞は、完全にコンフルエントな細胞を得るために4-5日間、5%CO 2インキュベーターを加湿しました。
- 完全にT75フラスコ中で増殖させたコンフルエントたCaco-2細胞は、その後、細胞を洗浄PBSを吸引するためにPBSフリー2+ の Ca 2+およびMgの10ミリリットルを追加します。二回、この手順を繰り返します。
- 37°Cで0.05%トリプシン/ EDTA溶液1mlを加え、インキュベートを5分間、5%CO 2インキュベーターを加湿しました。
- ピペッティングによって、および3〜5回上下(FBS付き)予め温めておいた完全な細胞培養培地10ミリリットルで解離した細胞を再懸濁します。
- cで細胞懸濁液をスピンダウン5分間、500×gでentrifugation、その後、上清を除去します。
- デバイスで〜1.5×10 5細胞/ cm 2で細胞密度を調整するために、再び1ミリリットルで予め温めておいた再懸濁完全培地。細胞密度を推定するために、血球計数器を使用してください。
- 上部のマイクロチャネルに接続されたチューブの出口に25 G5 / 8針に取り付けられた1ミリリットルの使い捨て注射器を配置することにより、上部マイクロチャネル(管腔側)に再懸濁させたCaco-2細胞100μlを注入。
- バインダークリップを使用して、上下のマイクロチャネルに接続されたチューブのすべての入口と出口をクランプ。
- 1時間37℃で、加湿した5%CO 2インキュベーターで全設定をインキュベートし、多孔質膜の表面に付着したCaco-2細胞を解離可能にします。
- クランプを外し、細胞は24-36時間、無傷の単層を形成するまで、シリンジポンプを用いて30μlの/ hrでのみ上位マイクロチャネルに培養液の流れを再開します。位相コントラを使用します細胞単層において細胞間結合を確認するため、Tまたは微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡。
- 細胞は単層を形成する場合、30μL/時の同じ流速で両方の上部(ルーメン)と下部(毛細管)マイクロチャネルに培地を灌流。
- 蠕動運動のような動き5,9を模倣する機械的変形の応用。
- テンション装置を搭載した真空ポンプの電源を入れます。
- ステンレス製のコネクタとチューブを介して真空コントローラに真空チャンバーを接続します。
- 真空制御ソフトウェア上の巡回正弦関数モードで0.15ヘルツの周波数で10%、平均細胞株の伸縮運動を設定し、「スタート」をクリックします。
- 〜100時間のための機械的変形の下でコンフルエントのCaco-2単層に上下マイクロチャネルにおける培地の一定流量(30μL/時)(10%、0.15 Hz)を維持します。
注:たCaco-2細胞はSPONtaneously上皮マイクロチャネル5,8-10の内腔に向かって延長起伏3Dの突起と絨毛の形態形成を受けます。
- 記載されているように腸オンチップ10におけるルーメン毛細血管組織界面で生きている人間の腸の器官レベルの機能をエミュレートするには、手順に従ってください。
- 2.1から2.2までの手順を繰り返して、マイクロ加工のCaco-2絨毛を成長させます。
- 予熱した共培養培地フロー(完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1:1 v / v)を30μL/時間で上下マイクロチャネルへ。
- 解離した正常なヒト毛細血管の微小血管内皮細胞の100μlの紹介(HMVECを、最終細胞密度を、〜5.0×10 5細胞/ cm 2)2.2.3から2.2.9までの手順で説明する同一の方法により、低いマイクロチャネルへ。
- 硬化した長方形のPDMSピースを置きます(0.5センチメートルのx 1センチメートルのx 1センチメートル;幅×長さ×高さ; 15:1、ワット/ワットエラストマー:硬化剤))腸オンチップデバイスの上に、その後、逆さま全体のデバイスのセットアップを反転( すなわち、上側のマイクロチャネルは、マイナス面に面しており、下側のマイクロチャネルは、上方に向いています。
- 解離したHMVECをが低いマイクロチャンネル内での多孔質膜の表面に付着することを可能にするために1時間、37℃、加湿5%CO 2インキュベーターでセットアップをインキュベートします。
- CO 2インキュベーターから全体のセットアップを取り出し、再び上でセットアップを反転させます。
- 予熱共培養培地フロー(完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1:1 v / v)の機械的伸張運動と30μL/時間(時上側と下側のマイクロチャネルの両方に10%、0.15 Hz)で内皮単層の細胞間接合を形成するために、少なくとも3日間。
ガット・オン・チップマイクロデバイス3.ホスト腸Microbiome共培養
- 前培養Oを実行F細菌細胞をマイクロ加工腸絨毛上に同時培養共生腸microbiomeを次のように。
- オートクレーブラクトバチルスMRSブロス及び強化クロストリジウム培地(v / v、1:1)混合液10mlに凍結乾燥されたプロバイオティクス細菌の粉末混合物を再懸濁します。
- 10 mlの使い捨ての滅菌チューブにアリコートその後、菌体懸濁液を3mlの培地を適量添加することにより(600nmで)約0.2の光学密度単位の最終細胞密度を調整します。
- 嫌気性容器中に再懸濁させた微生物細胞を含む場所チューブ。コンテナ内の嫌気性ガス発生サシェの2つのパックを追加します。しっかりと容器の蓋を閉め、37℃で振盪せずにコンテナの設定をインキュベート、5%CO 2インキュベーターO / Nを加湿。
- 腸上皮細胞5,10とMicrobiomeとの共培養の接種。
- 脱気antibiotiを含む3ミリリットル使い捨て注射器を準備しますC無細胞培養培地( すなわち、20%FBSを含むDMEM)。培養液の脱気手順については2.1.6を参照してください。
- バイオセーフティキャビネットに移動した後、CO 2インキュベーターからマイクロ加工絨毛を含む腸オンチップデバイスの全体的なセットアップを行ってください。
- 上下のマイクロチャンネルにリンクされているチューブに接続された注射器を取り外します。その後、前microbiomeの播種に12時間、この抗生物質を含まない培地を流れ、CO 2インキュベーターに戻す、デバイスに3.2.1で調製した注射器を接続します。
- 5分間万×gで(3.1の手順を参照してください)前培養したプロバイオティクス細菌の混合細胞をスピンダウン。真空を用いて上清て吸引し、次いで(〜、最終細胞密度1.0×10 7 CFU / ml)を、抗生物質を含まないDMEM培地中に再懸濁します。
- 25に取り付けられた1ミリリットル使い捨て注射器を使用して、「無菌」腸絨毛を含むマイクロチャネルの内腔側に細胞懸濁液を注入G5 / 8針。すべてのチューブ端にクランプすることにより、流れずに〜1.5時間腸絨毛の頂端表面に微生物細胞の接着を可能にします。
- 巡回リズミカルな変形(10%、0.15ヘルツ)と40μlの/時間で、上下のマイクロチャネルの両方に予熱した抗生物質を含まない培地を灌流。
- 緑色蛍光タンパク質(GFP)の共培養のためにEを標識大腸菌 (GFP 大腸菌 ;非病原性DH5アルファ大腸菌宿主)マイクロ加工絨毛と10,11細胞、プレ育成GFP E. 12時間の条件(200 rpm)し振とうしながら37℃でオートクレーブしたLB培地中の大腸菌細胞。 GFP Eの共培養を行うために3.2.5から3.2.6への手順を繰り返しますマイクロ加工絨毛とcoli細胞。
- 画像セル5,8-10
- DIC、エピ蛍光、または微生物と上皮形態の5,8,10を記録するためのレーザー走査型共焦点顕微鏡を実行します。
- DICイメージングのために、CO 2インキュベーターから腸オンチップマイクロシステムのセットアップを取り出し、その後、細胞形態を記録し、顕微鏡のステージ上でのデバイスのセットアップを配置します。
- 絨毛上皮の蛍光イメージングのために、10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
- 15分間、4%(w / v)のパラホルムアルデヒドで絨毛を修正しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
- 0.3%と絨毛を透過(v / v)のトリトンX-100で10分間、2%(w / v)のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで希釈しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
- 1時間PBS中の2%のブロック細胞(w / v)のBSA溶液。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
- 4の300 nMの「光保護下で核染色のためにPBSで希釈し、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸(DAPI)溶液を加えます。
- 蛍光ファロイジンの25単位/ mlを追加します。光の保護の下でF-アクチン染色にPBSに溶解(ファロイジン-CF647複合体)です。
- レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光染色した細胞の記録画像。
注:25Xの目的は、共焦点顕微鏡の間に適切な光学ズームで塗布しました。 図3Bにおいて、約525Xの倍率を使用しました。
- DIC、エピ蛍光、または微生物と上皮形態の5,8,10を記録するためのレーザー走査型共焦点顕微鏡を実行します。
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Representative Results
in vitroでのヒトの腸ホストmicrobiomeのエコシステムをエミュレートするために、それはあります このような蠕動運動のような力学や流体の流れのような生理的条件下で腸内細菌とヒト腸上皮細胞の安定した長期の共培養を再構成するための実験プロトコルを開発するために必要。ここでは、生体模倣腸オンチップマイクロデバイスを利用します ( 図1A)共培養in vitroでの週間以上の期間に、人間の絨毛を生きていると直接接触して微生物細胞を生きます。腸上皮細胞は自発的に高分化絨毛を形成する場合に生理学的に関連する流体の流れおよび環状機械的変形5の存在下で2チャンネルのマイクロ流体デバイスの1チャネルにおける多孔質のECMコーティングされた膜の一方の側に培養しました。マイクロ加工絨毛はformati含むヒトの小腸絨毛の構造と機能を複製します頂端刷子縁が並ん円柱上皮細胞、移行および絨毛先端、粘液産生、強化された薬物代謝活性、および増加したグルコースの再取り込み8の高レベルの地下室から進行する娘細胞の分化と基底増殖陰窩の上。生きた内皮細胞は、腸壁の組織-組織界面を再作成するために同じ膜の反対側上で培養することができ、免疫細胞は、ウェル10のシステムで培養することができます。腸上皮細胞、腸オンチップ内に形成された腸絨毛のタイトジャンクションバリアの保護機能を検証するために断続的に経上皮電気抵抗(TEER)5,10,12を測定することによって定量されます。 TEER値のルーチンモニタリングは各時点で細胞単層または腸絨毛の完全性を推定するために必要とされる( 例えば、内腔の中に細菌を添加する前に)。
7 CFU / ml)を、抗生物質を含まない細胞培養培地に再懸濁微生物細胞を生きた、ホスト微生物の生態系を再確立するには、上皮マイクロチャネルの内腔に接種します( 図1B、「接種」)。微生物細胞は、〜1.5時間の流れが存在しない( 図1B、「添付ファイル」)、生理的な流れ(40μL/時)に絨毛の先端表面に付着した後(巡回機械的変形との両方のチャネルを介して10%歪みで再開され、両方の細菌および絨毛上皮細胞( 図1B、「共培養」)に結合していない腸内細菌と供給栄養素を除去するための0.15ヘ ルツ)。この共培養プロトコルは、生菌微小コロニーは、共培養( 図2A、2B)で2週間まで維持されていると、intervillus空間でプロバイオティック細菌の複数種の安定した定着を可能にします。この研究では、コ8別の通性または偏性嫌気性の混合集団が含まれていmmercialプロバイオティクス製剤、 ビフィドバクテリウムブレーベ 、Bのプロバイオティック株ロンガム 、B。ティス 、 ラクトバチルス・アシドフィルス 、L。プランタラム 、L.パラカゼイ 、L。ブルガリ 、およびストレプトコッカス・好熱菌が使用されます 。
この共培養法は広くヒト腸宿主微生物生態系をエミュレートするために適用することができます。例えば、非病原性GFP E.大腸菌は腸オンチップデバイスで成長した腸絨毛の表面に共培養することができます。同じプロトコルに基づいてGFP E.付着し、上述の大腸菌絨毛上の細胞をintervillus空間に散水下で培養した場合( 図3B、1時間対72時間)を見つける3日間で複数の微小コロニー( 図3A、1時間対72時間)に1時間で、単一の細胞から成長します流れ(40μL/蠕動運動のような変形(10%、0.15ヘルツ)の存在下での時間)。
図1. 人間の腸オンチップホスト腸microbiomeの共培養のためのmicrophysiologicalシステム。(A)写真(左)と2チャンネルの概略(右)、消化管・オン・チップマイクロ流体デバイス。矢印は、培養液の流れの方向を示している(青色、上部マイクロチャネルを、赤色、底部マイクロチャネル)を。腸・オン・チップ内のホスト腸microbiome共培養の手順の(B)模式図。腸上皮細胞は、絨毛(約100時間)を形成した後、細胞培養培地中に再懸濁した微生物細胞はルーメンマイクロチャネル(接種)に導入され、その後、培養培地の流れは、〜1.5時間(添付)のために中断されます。微生物細胞が腸絨毛の頂端表面に付着した後、流れが再開される(コ -culture)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
腸オンチップで腸絨毛を持つ複数のプロバイオティック細菌の 図2. 共培養。(A)微分干渉顕微鏡写真は、腸チップ内の絨毛の間に成長しているプロバイオティクス細菌細胞の微小コロニーを示しています。プロバイオティクス細菌細胞の微小コロニー(赤い矢印)を示す(B)Aの高い電力倍率ビュー(黒い点線の四角)。 V、絨毛。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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非病原性、GFP標識した 大腸菌 の 図3 の共培養 腸オンチップで腸絨毛を持つ 大腸菌 。(A)オーバーレイ蛍光およびDIC顕微鏡画像は、GFP Eの定着を表示し、1および72時間で採取されました腸オンチップで成長した腸絨毛上の大腸菌 。 (B)GFP標識E.の成長を示す1および72時間で採取されたオーバーレイされた蛍光共焦点顕微鏡写真のハイパワー倍率ビュー微小コロニーに単一のセル(赤矢印)からの大腸菌 (白矢印)。ブルー、核;マゼンタ、Fアクチン。スケールバー=30μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ホストmicrobiomeの相互作用を理解することは、医療を進めるために重要です。微生物細胞は、主にin vitroで哺乳動物細胞を過増殖しているためしかし、プラスチック皿または静的ウェルプレートで行われる伝統的な細胞培養モデルは、以上1-2日のために生き腸内微生物とヒト腸細胞の安定な共培養をサポートしていません。過剰成長微生物集団は急速に続いて深刻な腸のバリア機能を損なうおよび腸上皮細胞死を引き起こす代謝性廃棄物( 例えば、有機酸)の過剰量を生成する、酸素と栄養素を消費します。したがって、栄養素の枯渇を引き起こす微生物の異常増殖および微生物の廃棄物の蓄積を防止することが共培養微小環境に(数日から数週間から)長期間実行可能なホストmicrobiome共存を維持するために重要です。
、microphysiologicalをこれらの課題を克服するために、腸オンチップ装置5,8は、完全に分化したヒト腸絨毛を形成し、 インビトロでの腸管腔の定常状態の微小環境を維持するために開発されました。腸オンチップマイクロ流体デバイスの設計と機能ユニット( 例えば、マイクロ流体フローセルチャンバー、真空駆動型の環状変形)は、正確に生理をエミュレートするために、微生物の共培養5のための物理的および化学的微小環境を変更されます10。腸オンチップマイクロ流体文化に適用されるせん断応力は、ヒトの腸5,13内腔の流れの生理学的範囲によって決定しました。ホスト微生物の共培養のために、腸オンチップの管腔マイクロチャネル内微生物集団の「定常状態」を維持することは、化学的および栄養的に実現可能な条件を支える上で重要です。腸オンチップマイクロシステムでは、measuriによって腸オンチップに内腔定常状態を推定することができます培地と微生物細胞密度のpHをngの。新鮮な培地を連続的にマイクロチャネルを通って流れるので、微生物細胞の初期播種密度、培地の体積流量が最適化されたとき、微生物および上皮細胞の両方が、栄養枯渇を受けません。マイクロチャネルを通過する馴化培地は、定義された体積流量(ここでは、40μlの/時間)で流出するので、代謝性廃棄物( 例えば、有機酸)、ならびに携帯secretomes( 例えば、サイトカイン)を連続的に同時から削除されます培養微小環境。したがって、腸オンチップデバイスがの生成を容易に必要かつ効果的に腸のマイクロチャネルの内腔から結合していないか、生い茂った微生物細胞を洗浄するのに十分な定常状態の微小環境との「連続バイオリアクター」、と考えることができます2-3日以内に安定した微生物のニッチ。
重要なファがあります。腸絨毛上の微生物細胞の成功した共培養のためのトラブルシューティングとして考慮されなければならないctors。まず、微生物の付着は、微生物種の間で変化することができるので、絨毛の表面に付着する微生物細胞に必要な最適化されたインキュベーション時間を決定する必要があります。例えば、 ラクトバチルスラムノサス GG 5、などのプロバイオティクス細菌は、一般的に取り付けるための〜1.0から1.5時間が必要ですが、いくつかの他の微生物種は、それらの接着動態14に応じて、( 例えば、病原性微生物)より短いまたはより長い時間を必要とするかもしれません。過度の微生物細胞数が安定した定常状態の達成を妨害することができる共培養の初期段階における細菌の成長につながる可能性があるため、第二に、微生物細胞の初期播種密度が特定されるべきです。この播種密度を最適化するために、antibiにターゲット微生物株の増殖プロフィールを特徴付けるために推奨されます様々な播種密度で耳を含まない細胞培養培地。最後に、体積流量の調節は、微生物種に応じて必要とされ得ます。微生物細胞は非常に急速に増殖している場合たとえば、増加流量が必要となります。これは、実験流量までを300μl/時間(0.2ダイン/ cm 2で )バリア機能及びマイクロ加工絨毛(データは示していない)の細胞形態を損なわないことが確認されました。なお、 ラクトバチルス・ラムノサス GG 5、店頭プロバイオティクスの混合物、VSL#3、非病原性実験室株E.大腸菌だけでなく、病原性腸侵入E.コリ株10が正常に腸オンチップでの長期共培養のために適用された、まだ、病原性感染性微生物の共生腸内細菌叢からの微生物種の多様性をテストするために必要とされます。 インビトロでの微生物細胞のcultivabilityが存在下または非存在下で考えられるべきですunculturable腸microbiomeの栽培試験は興味深い課題である共生と進化の文脈において、宿主細胞の。最後に、腸オンチップの両方の好気性と嫌気性微生物の共培養のための堅牢なプロトコルは、将来的に発見することが重要で満たされていない必要性があります。
このような一次腸上皮またはクローン病または結腸直腸癌などの特定の胃腸疾患を有する個々のヒト被験者からの未分化幹細胞の使用などの更なるモデルを改善するために取ることができるステップがあります。または人工多能性幹細胞(性IPSC)。しかし、人間の健康と病気を組織内の人間microbiomeの役割で急成長関心を持って、私たちのホストmicrobiome共培養方法は、ヒトの体で見つかった他のホストmicrobiomeの生態系を模倣するために適用される大きな意義と可能性を秘めている( 例えば 、 、口腔15、皮膚16、または泌尿生殖器トンRACT 17)。最後に、この共培養方法は、新しい薬剤化合物の生物学的利用能、有効性、および毒性にどのように腸のmicrobiomeの影響の観点から予測可能性を改善することにより、従来の医薬品開発プロセスを革新することができます。一緒になって、腸オンチップmicrophysiologicalシステムは、ホストmicrobiomeエコシステムを再構成するために使用することができる安定した定常状態腸内微小環境を確立するための強固なプラットフォームを提供することができます。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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