תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שבו בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יוצאים מגוף האנדותל hemogenic קיים במגוון רחב של אתרי hematopoietic עובריים כגון האאורטה-בלוטת המין-כלה ואת 1,2 השליה. חוסר יכולת התרבות HSCs במבחנה מונעת עומק בניתוח של התהליך הזה, כמו גם את היישום הקליני של מחקרים אלה. כדי לעקוף מגבלה זו, מחקרים קודמים ניסו לגזור HSCs דה נובו או דרך בידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) 3, או פלסטיות מושרה בתאים הסומטיים בידול מכוון באמצעות מדיה תכנות מחדש 4,5. מחקרים אלה, לעומת זאת, לא לייצר תאי engraftable בטוחים קליני או לאפשר מחקר של hematopoiesis התפתחותי הסופי "בצלחת".
עבודת הרומן שהקימה יאמאנאקה ועמיתיו ליצור מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) מ- p פיברובלסטים סומטייםrovides מסגרת גורם שעתוק (TF) אסטרטגיות ביטוי יתר מבוססות גורל תא תכנות מחדש 6,7. עבודה זו הביאה חוקרים בתחומים שונים כדי ליצור סוגי תאים של בחירה באמצעות תכנות מחדש TF של תאים סומטיים להשגה בקלות. מטרת אסטרטגית תכנות מחדש המתוארת כאן היא להשפיע על תהליך hemogenic מן תאי הסומטיים עכבר באמצעות גישת תכנות מחדש מבוסס TF במטרת תרגום ממצאים אלה למערכת האנושית לתכנת מחדש fibroblasts מטופל ספציפי כדי ללמוד hematopoiesis האנושי במבחנה ליצור מוצרי דם מטופל ספציפי עבור מודלי מחלה, בדיקות סמים, גזע השתלה תאית.
הצעד הראשון כדי להבטיח תכנות מחדש נאה במערכת העכבר הזה היה לפתח קו כתב ששמש מחוץ קריאה לביטוי CD34, סמן ידוע ובתאי אנדותל HSCs. כדי לעשות זאת, קווי huCD34-TTA ו TETO-H2BGFP העכבר המהונדסים שמשו gפיברובלסטים עובריים בעכבר כפול enerate מהונדס (MEFs), עכשיו מסומן 34 / H2BGFP, כי לזרוח ירוק באקטיבציה של האמרגן CD34 8. זה איפשר הקרנת מגוון של TFS ידוע להידרש בנקודות שונות במהלך מפרט hematopoietic ופיתוח. החל 18 TFS וקטורים retrovial PMX (נקבע באמצעות כריית ספרות פרופיל של תווית GFP שמירה HSCs מן שתואר לעיל 34 / H2BGFP עכברים), 34 / H2BGFP MEFs היו transduced עם כל הגורמים ותרבותי על AFT024 HSC-תאים תומכים סטרומה. לאחר זיהוי של הפעלת 34 / H2BGFP, TFS שהועבר בפועל מקוקטייל תכנות מחדש עד ששקעה האופטימלי של TFS להפעלת כתב זוהה. לאחר מסך ראשוני זה, הגורמים הועברו מערכת וקטור DOX מושרה pFUW לאפשר ביטוי לשליטה של TFS. מאז שתי אלה מערכות לשליטת DOX אינן עולים בקנה אחד (תאי 34 / H2BGFP ואת וקטורי pFUW המושרים), MEFs מwild-type C57BL / 6 עכברים נדרשו. זה היה גם צורך לספק microenvironment שראוי לאפשר hemogenesis כדי להמשיך וליצור אבות clonogenic multilineage.
מחקרים עכשוויים המנסים לתכנת מחדש תאי סומטיים לתאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs) נפגשו רמות מגוונות של הצלחה 9-11. נכון להיום, דור שני עכבר HSPCs להשתלת אדם עם לטווח ארוך ויכולת repopulating עצמית חידוש שלא הושג באמצעות אותה הקבוצה של TFS. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה הוקמה בעבר לגרום hemogenesis reproducibly ב MEFs. אנו מדגימים הקדמה של מספר מינימאלי של TFS (Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6) מסוגל ייזום תכנית התפתחותית מורכבת במבחנה המספקת פלטפורמה שבאמצעותה hematopoiesis התפתחותיים יישום קליני של תכנות מחדש hematopoietic ניתן ללמוד עוד 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת HSPCs דה נובו מן התאים הסומטיים להשגה בקלות מציעה שיטה ייחודית ללמוד hematopoiesis במבחנה, וההזדמנות פוטנציאל ליישם את הטכנולוגיה הזו על המערכת האנושית. התרגום הזו יעורר כלי חדש ללמוד מחל המטולוגית אדם בצלחת, כמו גם לספק פלטפורמות בבדיקת סמי גן מיקוד הזדמנויו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
