disaccharide लैक्टोज के catabolic प्रोसेसिंग के लिए लैक्टेज की एंजाइमी गतिविधि जरूरी है । यहां, लैक्टेज की गतिविधि पूरक आहार में पाया परख एक वर्णमिति परख का उपयोग कर रहा है । यह लैक्टेज और एंजाइम कैनेटीक्स की गतिविधि को समझने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के साथ छात्रों को प्रदान करता है ।
कैसे एंजाइमों काम समझ, और वास्तविक जीवन उदाहरण के लिए इस से संबंधित है, जैविक और जैव चिकित्सा विज्ञान में स्नातक की डिग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण है । यह आसान प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए पहले वर्ष स्नातक फार्मेसी छात्रों के लिए विकसित किया गया था और एंजाइम विश्लेषण के लिए एक प्रवेश स्तर का परिचय प्रदान करता है और विश्लेषक प्रतिक्रियाओं के लिए विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं । विकल्प के एंजाइम लैक्टेज है, के रूप में यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव रोग के लिए प्रासंगिक एंजाइम/दवा अभ्यास का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है । लैक्टेज आहार अनुपूरक गोलियों से निकाला जाता है, और लैक्टेज के लिए एक कृत्रिम सब्सट्रेट के hydrolysis पर आधारित एक वर्णमिति परख का उपयोग मूल्यांकन (ऑर्थो-nitrophenol-बीटा-डी-galactopyranoside, ONPG). ऑर्थो की रिहाई-लैक्टेज द्वारा ONPG के hydrolytic दरार के बाद nitrophenol ४२० एनएम में अवशोषक में परिवर्तन द्वारा मापा जाता है, और एंजाइमी प्रतिक्रिया पर तापमान के प्रभाव के बाहर बर्फ पर प्रतिक्रिया ले जाने से मूल्यांकन किया है, कमरे के तापमान पर और ३७ पर ° c. और अधिक उंनत विश्लेषण विभिंन स्थितियों के तहत एंजाइम गतिविधि का आकलन है और विभिंन रिएजेंट का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कार्यांवित किया जा सकता है ।
एंजाइमों प्रोटीन का एक विशेष प्रकार है कि जीव1में रहने वाले रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए जैविक उत्प्रेरक के रूप में कार्य कर रहे हैं । एंजाइमों की कार्रवाई जीवन के लिए महत्वपूर्ण है, ऊर्जा प्रदान करने, कचरे के निपटान और जीवों को कार्य करने की अनुमति । एंजाइमों को समझना है, इसलिए, जीवन की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है । इस तरह के ज्ञान विश्वविद्यालय स्तर के डिग्री कार्यक्रमों की एक विस्तृत विविधता के लिए आवश्यक है, चिकित्सा विज्ञान से जीव विज्ञान को लेकर. जबकि एक विस्तृत catalysis के सिद्धांतों से एंजाइम गतिविधि के सैद्धांतिक मॉडल को लेकर पृष्ठभूमि व्याख्यान और पठन सामग्री का उपयोग कर छात्रों को प्रदान किया जा सकता है, एंजाइम प्रतिक्रियाओं के गुणों का सबसे अच्छा व्यावहारिक अनुभव पर हाथ से समझ रहे हैं कार्रवाई में एंजाइमों के रूप में पहले2प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल एक सरल प्रयोगशाला शर्तों के तहत एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान का पालन करें, एक मानव पोषण और स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक गतिविधि के साथ एक एंजाइम का एक उदाहरण के रूप में लैक्टेज का उपयोग प्रदान करता है ।
glycosidic hydrolase लैक्टेज (ईसी 3.2.1.23/26) स्तनधारियों के लिए केंद्रीय पोषण महत्व के एक एंजाइम है3। लैक्टेज की गतिविधि अत्यधिक विकास के माध्यम से संरक्षित है, और बीटा-एंजाइमों के galactosidase परिवार से निकला- ई कोलाई से एक परिवार के माध्यम से होमो sapiens के लिए (चित्रा 1, PDB 1JZ8)4। एक मानव पोषण की स्थापना में लैक्टेज का महत्वपूर्ण महत्व इसके घटक monosaccharide घटकों में लैक्टोज के टूटने की अनुमति देने में अपनी भूमिका से उपजा है, जो तब शरीर में ऊर्जा उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लैक्टेज catalyzes में glycosidic बांड की hydrolysis को disaccharide लैक्टोज, जारी गैलेक्टोज और ग्लूकोज (figure2)5. ये monosaccharides तो मुख्य रूप से साइट्रिक एसिड चक्र और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण6के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । neonate और शिशु विकास के दौरान, लैक्टेज अत्यधिक मानव पाचन तंत्र में व्यक्त की है, जो लैक्टोज प्राथमिक कार्बोहाइड्रेट घटक है के स्तन के दूध से प्राप्त लैक्टोज को तोड़ने, और प्रारंभिक वर्षों के दौरान पोषण के प्रमुख स्रोतों में से एक 7. लैक्टेज के चिकित्सा महत्व जंमजात लैक्टेज कमी (CLD), एक दुर्लभ autosomal अवकाश लैक्टेज जीन (LCT) लैक्टेज एंजाइम8के लिए कोडिंग में उत्परिवर्तनों की वजह से स्थितिपर प्रकाश डाला है । CLD प्रदर्शन के साथ नवजात शिशुओं बहुत कम लैक्टेज गतिविधि, इस प्रकार वे मां के दूध, दूध के किसी भी अंय प्रकार, या लैक्टोज युक्त सूत्र पर नहीं खिलाया जा सकता है ।
बचपन के दौरान, लैक्टेज अभिव्यक्ति सामान्य रूप से कम है; हालांकि, प्रातः के बाद इस कमी भौगोलिक रूप से बदलता है, दुनिया भर में वयस्कों के लगभग ३५% के साथ एंजाइम9व्यक्त करने के लिए जारी । लैक्टेज की निरंतर अभिव्यक्ति, लैक्टेज हठ के रूप में जाना जाता है, व्यक्तियों के लिए स्रोतों की एक सीमा से दूध और डेयरी उत्पादों को पचाने में जारी रखने के लिए अनुमति देता है । इसके विपरीत, लैक्टेज अभिव्यक्ति की हानि लैक्टोज असहिष्णुता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वयस्क प्रकार hypolactasia (एथलीट) के रूप में भी जाना जाता है, एक अक्षमता पेट में लैक्टोज को तोड़ने के लिए जिसके परिणामस्वरूप. एथलीट लैक्टोज खाद्य उत्पादों युक्त की घूस के बाद बृहदांत्र में लैक्टोज का निर्माण की विशेषता है । बृहदांत्र में, संचित लैक्टोज आंत माइक्रोबियल जीव द्वारा किण्वित है, हाइड्रोजन, मीथेन, और कार्बन डाइऑक्साइड सहित gasses जारी । लैक्टेज एंजाइम की कमी के साथ व्यक्तियों में इन गैसों का उत्पादन पेट की सूजन को बढ़ावा देने, बढ़ा पेट फूलना, दर्द, मतली, और borborygmi (पेट rumbling)7. पाचन तंत्र में लैक्टोज का बढ़ता स्तर भी ढीला मल के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
LCT जीन अभिव्यक्ति का नियंत्रण पास के MCM6 जीन के introns में स्थित बहुरूपताओं द्वारा संग्राहक है. लैक्टेज की निरंतर अभिव्यक्ति के साथ व्यक्तियों बहुरूपताओं ले कि LCT जीन अभिव्यक्ति के लिए मजबूत बाहर बढ़ाने के रूप में कार्य करते हैं, इस प्रकार प्रातः के दौरान LCT प्रतिलेखन के सामांय विनियमन नीचे क्षतिपूर्ति, और फलस्वरूप वयस्कता में लैक्टेज अभिव्यक्ति बनाए रखने3. बढ़ाने बहुरूपताओं को सकारात्मक ५००० साल पहले9,10से अधिक मध्य पूर्व में मवेशियों और ऊंटों के घरेलूकरण के बाद चुना गया है सुझाव दिया गया है ।
एथलीट से उत्पन्न लक्षण लैक्टोज का सेवन कम करके प्रबंधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए आहार से डेयरी उत्पादों को हटाने के द्वारा. एथलीट के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, और CLD के लिए पसंद के दृष्टिकोण, लैक्टेज की खुराक का उपयोग है, फार्मेसियों से व्यापक रूप से उपलब्ध है. इन की खुराक स्रोतों की एक किस्म से पृथक लैक्टेज प्रदान करते हैं, खमीर और बैक्टीरिया सहित, एक तरल या गोली आधारित रूप है कि के साथ लिया जा सकता है या लैक्टोज युक्त भोजन में जोड़ा । पूरक ग्लूकोज और गैलेक्टोज उत्पादों के लिए भोजन में मौजूद लैक्टोज का अनुपात hydrolyze जाएगा, इस प्रकार उनके अवशोषण की अनुमति और पेट में अपच लैक्टोज सब्सट्रेट के संचय को रोकने.
एक आहार सहायता के रूप में लैक्टेज की खुराक के उपयोग पर आधारित है, हम एक सरल enzymology प्रयोगशाला प्रयोग पहले साल के लिए उपयुक्त विकसित किया है बायोमेडिकल साइंस या फार्मेसी छात्रों । इस प्रयोगशाला प्रयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लैक्टेज की खुराक का लाभ लेता है, और ऑर्थो का उपयोग करता है-nitrophenolबीटा-डी galactopyranoside (ONPG) वर्णमिति द्वारा glycosidic बांड के क्लीवेज को मापने के लिए एक लैक्टेज अंत बिंदु प्रदान करने के लिए ( चित्रा 3)11. ONPG लैक्टेज के लिए एक कृत्रिम सब्सट्रेट कार्य करता है, जो जब इस एंजाइम द्वारा hydrolysis के अधीन D-गैलेक्टोज और ऑर्थो-nitrophenol पैदा करता है. उत्तरार्द्ध उत्पाद एक पीला रंग है, ४२० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित । लैक्टेज को ONPG के जोखिम के बाद ४२० एनएम में अवशोषक में किसी भी परिवर्तन को बढ़ाता है, यह इस एंजाइम की गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए संभव है । इस प्रयोगशाला प्रयोग एंजाइमी hydrolase गतिविधि का एक प्रदर्शन प्रदान करता है । अतिरिक्त दोहराने में निर्माण और विभिंन स्थितियों में परख बाहर ले जाने से, यह एंजाइम कैनेटीक्स के अधिक परिष्कृत विश्लेषण शामिल संभव है, मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक कार्रवाई में एंजाइमों के एक मूल्यवान वास्तविक जीवन उदाहरण प्रदान ।
एक विस्तृत ज्ञान और एंजाइम, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और एंजाइम कैनेटीक्स की समझ जीव विज्ञान, जैव चिकित्सा और औषध फैले विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित एक एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक एंजाइम का एक उदाहरण के रूप में लैक्टेज का उपयोग करता है, महत्वपूर्ण कौशल है कि और अधिक उंनत प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रयोगों आधारित प्रदान ।
इस प्रोटोकॉल को जानबूझकर के रूप में संभव के रूप में मजबूत बनाया गया है, कम या कोई गीला प्रयोगशाला अनुभव के साथ छात्रों की अनुमति के लिए समय की एक छोटी जगह में व्याख्यात्मक परिणामों का उत्पादन । 2014/2015 में अकादमिक वर्ष के विश्वविद्यालय में पढ़ने के स्कूल ऑफ फार्मेसी, कुल १४४ छात्रों, 3 के समूहों में आयोजित, बाहर किया “मापने लैक्टेज” प्रयोग, सभी समूहों के साथ लैक्टेज गोली से एंजाइमी गतिविधि के कुछ स्तर का पता लगाने में सक्षम अर्क.
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों की एक संख्या है । सबसे पहले, यह आवश्यक है कि प्रारंभिक निष्कर्षण कुशल है, बाद में विश्लेषण के लिए पर्याप्त सक्रिय एंजाइम के solubilization की अनुमति । हमारे अनुभव में, प्रथम वर्ष के स्नातकों के रूप में उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करके इस लक्ष्य को प्राप्त कर सकते हैं; हालांकि प्रयोगशाला प्रदर्शनकारियों से कुछ मार्गदर्शन इस बिंदु पर की आवश्यकता थी । हालांकि यह एक आत्म स्पष्ट बात प्रतीत होता है, इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक के लिए ध्यान से मात्रा को मापने की क्षमता है, ठीक से लेबल ट्यूबों और निर्देशों का पालन करें । जबकि प्रवीणता के एक निश्चित स्तर पर कई छात्रों के लिए ग्रहण किया जा सकता है, सावधान निगरानी और छात्रों के लिए एक स्पष्ट अनुरोध करने के लिए घटना में सहायता के लिए पूछने के लिए कि वे क्या अगले एक सफल परख की सबसे बड़ी संभावना प्रदान करता है की अनिश्चित हैं ।
छात्र मूल्यांकन में वर्ग वर्कशीट द्वारा किया जा सकता है (पूरक सामग्री के रूप में उपलब्ध है), छात्रों को पूछने के प्रयोगों से डेटा नोट, उनके परिणामों पर टिप्पणी और पृष्ठभूमि जानकारी के लिए लिंक/व्याख्यान सामग्री से पढ़ने/ विस्तृत, मॉडल डेटा के साथ कक्षा मूल्यांकन के बाहर काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति दी और मूल्यांकन करने का प्रयास किया जाएगा ।
इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला शर्तों के तहत एक लैक्टेज गतिविधि परख का एक सरल उदाहरण है, और वहां पर्याप्त प्रयोग की जटिलता बढ़ाने के लिए और अधिक उंनत विश्लेषण की अनुमति का अवसर है । विशेष रूप से, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एंजाइम कैनेटीक्स की अवधारणा के लिए एक परिचय प्रदान करता है, लेकिन प्रयोगात्मक डेटा के काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है । इस तरह, हम कक्षाओं के लिए एक प्रारंभिक टेम्पलेट के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल को देखने की सिफारिश करेंगे, सटीक विवरण के लिए विशिष्ट उद्देश्य और छात्र पलटन प्रयोगों उपक्रम की प्रतिभा के अनुरूप अनुकूलित के साथ. विस्तारित प्रयोगों के उदाहरण शामिल हो सकते हैं: विभिन्न तापमान पर दोहराया माप, सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग, डेटा के काइनेटिक विश्लेषण (जैव रसायन छात्रों के लिए उपयुक्त/ कई अलग गोलियाँ और छात्रों को प्रत्येक में एंजाइम के विभिन्न गतिविधि का मूल्यांकन करने की अनुमति (नियंत्रण गोलियों के अलावा के साथ, फोरेंसिक विज्ञान के छात्रों के लिए उपयुक्त/गर्मी विकार के प्रभाव का आकलन, या बाहर ले प्रतियोगिता लैक्टेज के लैक्टोज या अवरोधकों के अलावा द्वारा प्रयोग (तालिका 1). लैक्टेज के काइनेटिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहले12प्रकाशित किया गया है ।
इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण ताकत यह है कि यह enzymology और एंजाइम कैनेटीक्स को एक वास्तविक चिकित्सा में enzymology के जीवन का मामला अध्ययन के साथ मूल परिचय को जोड़ती है । यह चिकित्सा, फार्मेसी, जैव चिकित्सा विज्ञान और संबंधित विषयों के छात्रों के लिए विशेष प्रासंगिकता के इस प्रयोगशाला प्रयोग करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि वहां दोनों एक गंभीर चिकित्सा हालत और एक अधिक व्यापक आहार लैक्टोज catabolism के साथ जुड़े मुद्दे को छात्रों के साथ चिकित्सा और नैतिक मुद्दों की एक विस्तृत श्रृंखला बढ़ाने का अवसर प्रदान करता है । यह चिकित्सा शर्तों के लिए आनुवंशिक परीक्षण आसपास के मुद्दों को शामिल कर सकते हैं, और जीन थेरेपी और आनुवंशिक परामर्श से संबंधित चर्चा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपयोग और औषधीय खुराक की बिक्री । एक प्रमुख सीमा है कि प्रोटोकॉल एंजाइम एकाग्रता के सटीक आकलन, निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल शुरू सामग्री के कारण के लिए अनुमति नहीं है । इस के लिए खाते में एक संशोधन, तथापि, परख के लिए एजेंट ग्रेड एंजाइम का उपयोग किया जाएगा । महत्वपूर्ण बात, यह भी लैक्टेज एंजाइम के लिए कैनेटीक्स के और अधिक सटीक गणना के लिए अनुमति होगी ।
अंत में, एक शिक्षण प्रयोगशाला वातावरण में लैक्टेज की गतिविधि परख प्रारंभिक चरण विश्वविद्यालय के छात्रों के लिए एंजाइम जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक मजबूत, आकर्षक और दिलचस्प परिचय प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
पाल एक पार्किंसंस ब्रिटेन रिसर्च फैलोशिप (अनुदान F1002) द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम एक MRC नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (mr/L010933/1) और द्वारा MRC कार्यक्रम अनुदान mr/N026004/1 से पाल करने के लिए, और द्वारा BBSRC की छात्राओं BB/M017222/ हम इस व्यावहारिक की पहली पुनरावृत्ति में भाग लेने के लिए पढ़ने के विश्वविद्यालय में MPharm भाग 1 छात्रों के 2014-15 पलटन धंयवाद, और उनके प्रतिक्रिया और इनपुट के लिए बाद में साथियों ।
Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
De-ionized water | NA | NA | |
Pestle and mortar | VWR | ||
Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
Pipettes | Gilson | ||
15 mL tubes | VWR | ||
1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
Vortex | Vortex genie 2 | ||
Centrifuge | Beckman | ||
Ice bucket | VWR | ||
Water bath | Thermo-Scientific | ||
Weighing scales | Thermo-Scientific |