CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт
Summary
В настоящем докладе описывается кубического протокол для уточнения полной толщины кожи мыши биопсию, и визуализировать экспрессии белка шаблоны, пролиферирующие клетки и себоцитов в одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий.
Abstract
Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Наружный слой эпидермиса состоит из межфолликулярного эпидермиса, который является многослойный чешуйчатый эпителий, покрывающий большую часть нашего тела, и эпидермальных придатков, таких как волосяные фолликулы и потовые железы. Эпидермис подвергается регенерации на протяжении всей жизни, и в ответ на травму. Это обеспечивается с помощью K14-экспрессирующие базальные популяции стволовых / прогениторных клеток эпидермиса, которые жестко регулируется несколькими регуляторных механизмов активных внутри эпидермиса и между эпидермиса и дермы. В данной статье описывается простой метод для выяснения полной толщины мыши биопсии кожи, и визуализировать паттерны экспрессии белка K14, Ki67 помеченных пролиферирующие клетки, нильский красный маркированы себоцитов и DAPI ядерной маркировки на одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить и количественную оценку анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий. Кубическая протокол йе лучший метод, доступный на сегодняшний день для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий в полной толщины биопсии кожи на одной резолюции клетки.
Introduction
Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Она состоит из трех основных слоев наружные эпидермис, дерму и подкожную клетчатку. Эпидермис является весьма регенеративных тканей. Это плоскоклеточный многослойный эпителий, состоящего в основном из кератиноцитов. Кератиноциты рождаются в базальном слое, и двигаться вверх через супрабазальных слои дифференцируя, и в конце концов они опадают во внешнем рогового слоя примерно через месяц после их рождения. Эпидермис развивается ряд придатков, включая волосяные фолликулы и сальные железы. Волосяные фолликулы также регенерируют в циклическом моды на протяжении всей жизни 1. Регенерационная способность эпидермиса включена наличием стволовых клеток и клеток – предшественников, которые расположены в базальном слое межфолликулярного эпидермиса и волосяных фолликул 2.
Многие сигнальные пути участвуют в развитии эпидермального и регенерации. Некоторые из них происходят в пределахтолько на эпидермис, такие как путь ежа. Другие сигнальные события происходят между дермы и эпидермиса 3. Например, Wnt сигналы от дермы , как полагают , являются важными для развития волосяного фолликула, и они секретируются дермального сосочка в начале анагена для активации волосяной фолликул выпуклость пролиферации стволовых клеток / клеток – предшественников и рост волосяного фолликула 4. Важно понимать клеточные и молекулярные механизмы, которые контролируют развитие эпидермальный и регенерации, чтобы лучше понять, как они могут быть возмущенных в регенеративной заболевания кожи, такие как рак кожи.
В данной статье описывается C Лира, U nobstructed B дождь I maging коктейли и omputational анализ (кубические) протокол C 5-7 уточнить целые препараты кожи монтирование, и визуализировать паттерны экспрессии белка в 3 -х измерениях на одном разрешении клеток с помощью конфокальной микроскопии. Кубическая метод предполагает погружение кожиткани в двух аминоспирт на основе химических коктейлей. Эти решения корректировать показатели преломления в образце кожи, оставляя ткань прозрачной и белки нетронутыми, что позволяет иммунологического в одной резолюции ячейки.
Используя этот CUBIC протокол, базальную и пролиферирующие популяции кератиноцитов в эпидермисе межфолликулярного и в волосяных фолликулах были обследованы в полной толщины кожи биопсий мышей дикого типа с использованием анти-Keratin14 (K14) и анти-Ki67 антител. Сальные железы в дикого типа биопсии кожи также были визуализированы с помощью Нила Красное окрашивание. И, наконец, базальные популяции кератиноцитов дикого типа и гиперпластических биопсии кожи YAP2-5SA-delta ; C сравнивали 8.
Этот протокол позволяет КУБИЧЕСКИЙ визуальную оценку экспрессии белка в полной толщины биопсии кожи в одной резолюции клетки, и является важным инструментом, чтобы оценить эпидермальный анатомию и морфологические дефекты в коже генетически модифицированныхмышей, и исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития эпидермальный и регенерации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Регуляторные механизмы, контролирующие развитие кожи и гомеостаз наиболее часто изучаются в 2D с использованием секционирования ткани и гистологическое окрашивание или мечение с антителами, что позволяет лишь ограниченную оценку морфологии кожи, клеточных популяций или экспрессии б…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим австралийской биоресурсы (Гарван Institute, Австралия), ресурсный центр по биологическому (UNSW Австралия) и уход за животными & Комитет по этике для поддержки с экспериментов на животных. Эта работа была поддержана Национальным здравоохранения и Совет по медицинским исследованиям Австралии (проект Грант APP1062720). Доктор Сезар П. Каналес является получателями стипендии НКНТИ-Бекас Чили (# 72101076). Г-н Bassem Akladios является получателем университета международной премии постдипломного по UNSW Австралии.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
