Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage
Summary
Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.
Abstract
La peau est essentielle pour notre survie. La couche externe est constituée de l'épiderme de l'épiderme interfolliculaire, qui est un épithélium pavimenteux stratifié qui couvre la majeure partie de notre corps, et les phanères comme les follicules pileux et des glandes sudoripares. L'épiderme subit la régénération pendant toute la vie et en réponse à une blessure. Ceci est activé par K14 exprimant des populations souches / cellules progénitrices épidermiques basales qui sont étroitement régulés par des mécanismes de régulation multiples actifs dans l'épiderme et entre l'épiderme et le derme. Cet article décrit une méthode simple pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine K14, Ki67 étiquetés cellules proliférantes, rouge Nil étiqueté sébocytes, et l'étiquetage nucléaire DAPI à la résolution de la cellule unique en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise et la quantification de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Le protocole CUBIC est ee meilleure méthode disponible à ce jour pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires en pleine épaisseur biopsies de la peau à la résolution d'une seule cellule.
Introduction
La peau est essentielle pour notre survie. Il se compose de trois couches principales de l'épiderme les extérieurs, le derme et l'hypoderme. L'épiderme est un tissu très régénérative. Il est un épithélium pavimenteux stratifié, composé principalement de kératinocytes. Les kératinocytes sont nés dans la couche basale, et se déplacent vers le haut à travers les couches suprabasales tout en différenciant, et finalement ils tombent dans la couche externe cornified environ un mois après leur naissance. L'épiderme se développe un certain nombre d'appendices, y compris les follicules pileux et des glandes sébacées. Les follicules pileux se régénèrent également de façon cyclique tout au long de la vie 1. La capacité de régénération de l'épiderme est activé par la présence de cellules souches et progénitrices qui sont situés dans la couche basale de l'épiderme interfolliculaire des follicules pileux et 2.
De nombreuses voies de signalisation ont été impliquées dans le développement et la régénération de l'épiderme. Certaines d'entre elles se produisent à l'intérieurseulement l'épiderme, telles que la voie Hedgehog. D' autres événements de signalisation ont lieu entre le derme et l' épiderme 3. Par exemple, les signaux Wnt du derme sont considérées comme importantes pour le développement des follicules pileux, et ils sont sécrétés par la papille dermique au début de la phase anagène pour activer le follicule pileux gonflement souches / progénitrices la prolifération cellulaire et la croissance des follicules pileux 4. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le développement de l'épiderme et de la régénération afin de mieux comprendre comment ils peuvent être perturbés dans les maladies régénératrice de la peau telles que le cancer de la peau.
Cet article décrit un lear C, U nobstructed B pluie I cocktails forgemagie et C analyse omputational (CUBIC) protocole 5-7 pour clarifier les préparatifs de la peau de montage entières, et de visualiser les profils d'expression des protéines dans les 3 dimensions à la résolution d'une seule cellule par microscopie confocale. La méthode CUBIC implique l'immersion de la peautissu en deux cocktails chimiques à base de aminoalcools. Ces solutions ajuster les indices de réfraction de l'échantillon de peau, en laissant le tissu transparent et les protéines intactes, ce qui permet immunodétection à une résolution à une seule cellule.
En utilisant ce protocole CUBIQUE, la base et la prolifération des populations de kératinocytes dans l'épiderme interfolliculaire et dans les follicules pileux ont été imagées en totalité des biopsies de peau d'épaisseur des souris de type sauvage en utilisant l'anti-Keratin14 (K14) et des anticorps anti-Ki67. Les glandes sébacées dans les biopsies de la peau de type sauvage ont également été visualisés en utilisant du Nil Rouge coloration. Enfin, les populations de kératinocytes basaux de type sauvage et hyperplasiques biopsies cutanées YAP2-5SA-Ac 8 ont été comparés.
Ce protocole CUBIC permet une évaluation visuelle de l'expression des protéines dans leur intégralité des biopsies de peau d'épaisseur à la résolution d'une seule cellule, et est un outil important pour apprécier l'anatomie épidermique et défauts morphologiques dans la peau d'organismes génétiquement modifiéssouris, et d'enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement de l'épiderme et de la régénération.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mécanismes de régulation contrôlant le développement de la peau et de l'homéostasie sont le plus souvent étudiées en 2D à l'aide de sectionnement des tissus et une coloration histologique ou marquage avec des anticorps, ce qui permet seulement une reconnaissance restreinte de la morphologie de la peau, des populations de cellules ou de l'expression de la protéine. Un certain nombre de méthodes ont été développées pour améliorer la visualisation de l'organisation spatiale des cellules e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Australian Bio-Resources (Garvan Institute, Australie), le Centre de ressources biologiques (UNSW Australie) et le soin des animaux et Comité d'éthique pour le soutien à l'expérimentation animale. Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale de l'Australie (Grant Project APP1062720). Dr. Cesar P. Canales est récipiendaires d'une bourse CONICYT-Becas Chile (# 72101076). M. Bassem Akladios est récipiendaire du Prix international de l'Université d'études supérieures par UNSW Australie.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
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