घन प्रोटोकॉल पूरा पर्वत त्वचा तैयारी में एकल कक्ष संकल्प पर प्रोटीन अभिव्यक्ति visualizes
Summary
इस रिपोर्ट में एक घन प्रोटोकॉल का वर्णन पूर्ण मोटाई माउस त्वचा बायोप्सी स्पष्ट है, और 3 डी में एकल कक्ष संकल्प पर प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न, proliferating कोशिकाओं, और sebocytes कल्पना करने के लिए। इस विधि त्वचा शरीर रचना विज्ञान और विकृति का सही आकलन सक्षम बनाता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों में असामान्य एपिडर्मल phenotypes की।
Abstract
त्वचा हमारे अस्तित्व के लिए आवश्यक है। बाहरी एपिडर्मल परत interfollicular एपिडर्मिस, जो इस तरह के बालों के रोम और पसीने की ग्रंथियों के रूप में एक स्तरीकृत स्क्वैमस हमारे शरीर, और एपिडर्मल उपांग के सबसे को कवर उपकला है के होते हैं। एपिडर्मिस जीवन भर और चोट के जवाब में उत्थान आए। यह बेसल एपिडर्मल स्टेम / पूर्वज सेल आबादी कि कसकर कई नियामक एपिडर्मिस के भीतर और एपिडर्मिस और डर्मिस के बीच सक्रिय तंत्र द्वारा विनियमित रहे हैं K14 व्यक्त रूप से सक्षम है। यह लेख एक सरल विधि का वर्णन पूर्ण मोटाई माउस त्वचा बायोप्सी स्पष्ट है, और K14 प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए, Ki67 कोशिकाओं proliferating लेबल, नील लाल लेबल sebocytes, और 3 डी में एकल कक्ष संकल्प पर DAPI परमाणु लेबलिंग। इस विधि सटीक आकलन और त्वचा शरीर रचना विज्ञान और विकृति की मात्रा का ठहराव, और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों में असामान्य एपिडर्मल phenotypes के लिए सक्षम बनाता है। घन प्रोटोकॉल वें हैई सबसे अच्छा तरीका एकल कक्ष संकल्प पर पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में आणविक और सेलुलर बातचीत की जांच करने के लिए तिथि करने के लिए उपलब्ध है।
Introduction
त्वचा हमारे अस्तित्व के लिए आवश्यक है। यह तीन मुख्य परतों बाहरी एपिडर्मिस, डर्मिस और हाइपोडर्मिस के होते हैं। एपिडर्मिस एक अत्यधिक पुनर्योजी ऊतक है। यह एक स्क्वैमस स्तरीकृत उपकला ज्यादातर केरेटिनकोशिकाओं से मिलकर है। केरेटिनकोशिकाएं बेसल परत में पैदा होते हैं, और suprabasal परतों के माध्यम से ऊपर की ओर ले जाते हैं जबकि फर्क है, और अंततः वे अपने जन्म के बाद एक महीने के बारे में बाहरी श्रृंगित परत में बहा रहे हैं। एपिडर्मिस बालों के रोम और चिकना ग्रंथियों सहित उपांग की एक संख्या विकसित करता है। बालों के रोम भी जीवन 1 भर में एक चक्रीय फैशन में पुनर्जन्म। एपिडर्मिस के पुनर्योजी क्षमता स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं कि interfollicular एपिडर्मिस और बाल कूप 2 के बेसल परत में स्थित हैं की उपस्थिति से सक्षम है।
कई संकेत दे रास्ते एपिडर्मल विकास और उत्थान में फंसाया गया है। इनमें से कुछ के भीतर होते हैंकेवल इस तरह का हाथी मार्ग के रूप में एपिडर्मिस। अन्य संकेत घटनाओं डर्मिस और एपिडर्मिस 3 के बीच जगह ले लो। उदाहरण के लिए, डर्मिस से Wnt संकेतों बाल कूप विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, और वे ऐनाजेन को सक्रिय करने की शुरुआत में चमड़े का papilla द्वारा स्रावित होते हैं बाल कूप उभार के स्टेम / पूर्वज सेल प्रसार और बाल कूप विकास 4। यह सेलुलर और आणविक तंत्र है कि एपिडर्मल विकास और उत्थान नियंत्रण बेहतर समझने के लिए कैसे वे इस तरह के त्वचा कैंसर के रूप में पुनर्जन्म का त्वचा रोग में परेशान किया जा सकता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
यह लेख एक सी लियर का वर्णन है, यू बी बारिश मैं maging कॉकटेल और सी omputational विश्लेषण (घन) प्रोटोकॉल 5-7 nobstructed पूरे माउंट त्वचा की तैयारी स्पष्ट है, और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कक्ष संकल्प पर 3 आयामों में प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए। घन विधि त्वचा का विसर्जन शामिलदो aminoalcohol आधारित रासायनिक कॉकटेल में ऊतक। ये समाधान त्वचा के नमूने में अपवर्तक सूचकांक समायोजित, ऊतक पारदर्शी और प्रोटीन बरकरार छोड़ रहा है, एकल कोशिका संकल्प पर immunodetection की इजाजत दी।
interfollicular एपिडर्मिस में और बाल कूप में इस घन प्रोटोकॉल, बेसल का प्रयोग और keratinocyte आबादी proliferating विरोधी Keratin14 (K14) और विरोधी Ki67 एंटीबॉडी का उपयोग wildtype चूहों के पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में imaged थे। wildtype त्वचा बायोप्सी में वसामय ग्रंथियों भी नील लाल धुंधला का उपयोग कल्पना थे। अन्त में, wildtype और hyperplastic YAP2-5SA-ΔC त्वचा बायोप्सी में बेसल keratinocyte आबादी 8 की तुलना में थे।
इस घन प्रोटोकॉल एकल कक्ष संकल्प पर पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य आकलन सक्षम बनाता है, और एपिडर्मल शरीर रचना विज्ञान और आनुवंशिक रूप से संशोधित की त्वचा में रूपात्मक दोष सराहना करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैचूहों, और एपिडर्मल विकास और उत्थान अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
नियामक त्वचा विकास और homeostasis को नियंत्रित तंत्र सबसे अधिक ऊतक सेक्शनिंग और histological धुंधला या लेबलिंग एंटीबॉडी के साथ है, जो केवल त्वचा आकृति विज्ञान, सेल आबादी या प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक प्रतिबंधित प्रशं?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जानवर प्रयोग के साथ समर्थन के लिए ऑस्ट्रेलियाई जैव संसाधन (Garvan संस्थान, ऑस्ट्रेलिया), जैव संसाधन केन्द्र (UNSW ऑस्ट्रेलिया) और पशु की देखभाल और आचार समिति को धन्यवाद। इस काम के लिए ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान APP1062720) द्वारा समर्थित किया गया। डॉ सीजर पी Canales एक CONICYT-Becas चिली छात्रवृत्ति (# 72101076) के प्राप्तकर्ताओं है। श्री Bassem Akladios UNSW ऑस्ट्रेलिया द्वारा विश्वविद्यालय के अंतर्राष्ट्रीय स्नातकोत्तर पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
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