Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount
Summary
Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.
Abstract
A pele é essencial para a nossa sobrevivência. A camada epidérmica exterior consiste da epiderme interfolicular, que é um epitélio escamoso estratificado que cobrem a maior parte do nosso corpo, e apêndices epidérmicos, como os folículos pilosos e glândulas sudoríparas. A epiderme é submetido a regeneração e ao longo da vida em resposta a lesão. Isso é ativado por K14-expressando populações / células progenitoras-tronco epidérmicas basais que são fortemente regulados por múltiplos mecanismos reguladores ativos dentro da epiderme e entre epiderme e derme. Este artigo descreve um método simples para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteína K14, Ki67 rotulados células em proliferação, Nile Red marcado sebócitos e rotulagem nuclear DAPI em resolução de uma única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa e quantificação da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados. O protocolo cúbica é the melhor método disponível no momento para investigar as interações moleculares e celulares em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula.
Introduction
A pele é essencial para a nossa sobrevivência. É composto por três camadas principais, a epiderme exterior, a derme e hipoderme. A epiderme é um tecido altamente regenerativa. É um epitélio escamoso estratificado, que consiste principalmente de queratinócitos. Queratinócitos nascem na camada basal, e mover-se para cima através das camadas suprabasais diferenciando, e, eventualmente, eles são eliminados na camada córnea exterior cerca de um mês após o seu nascimento. A epiderme se desenvolve uma série de apêndices, incluindo os folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os folículos pilosos também regenerar de forma cíclica ao longo da vida 1. A capacidade de regeneração da epiderme é activado pela presença de células estaminais e progenitoras que estão localizados na camada basal da epiderme e folículo capilar interfoliculares 2.
Muitas das vias de sinalização têm sido implicados no desenvolvimento e regeneração epidérmica. Alguns destes ocorrem dentroapenas a epiderme, tais como a via hedgehog. Outros eventos de sinalização ocorrem entre derme e epiderme 3. Por exemplo, os sinais de Wnt da derme são considerados como sendo importantes para o desenvolvimento do folículo de cabelo, e que são segregadas por a papila dérmica no início da fase anágena para activar a proliferação de células estaminais / progenitoras do folículo de cabelo e crescimento protuberância folículo piloso 4. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam o desenvolvimento epidérmica e regeneração para entender melhor como eles podem ser perturbado na doença de pele regenerativa, como câncer de pele.
Este artigo descreve um lear C, U nobstructed B chuva Eu cocktails maging e C análise omputational protocolo de 5-7 (cúbico) para esclarecer preparações para a pele de montagem integrais, e visualizar os padrões de expressão de proteína em 3 dimensões com resolução de uma única célula por microscopia confocal. O método envolve a imersão de CUBIC peletecido em dois cocktails químicos à base de aminoálcool. Estas soluções ajustar os índices de refracção da amostra da pele, deixando o tecido transparente e as proteínas intactas, permitindo a imunodetecção de resolução de célula única.
Usando este protocolo cúbicos, a proliferação basal e populações de queratinócitos na epiderme interfoliculares e no folículo de cabelo foram fotografadas em biópsias de pele de espessura total de ratinhos de tipo selvagem utilizando anticorpos anti-Keratin14 (K14) e anticorpos anti-Ki67. As glândulas sebáceas em biópsias de pele de tipo selvagem também foram visualizados usando Nile Red coloração. Por último, as populações de queratinócitos basais em tipo selvagem e biópsias de pele YAP2-5SA-Sc hiperplásicos foram comparados 8.
Este protocolo permite CUBIC avaliação visual da expressão da proteína em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula, e é uma ferramenta importante para apreciar a anatomia da epiderme e defeitos morfológicos na pele de organismos geneticamente modificadosratos, e investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento da epiderme e regeneração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os mecanismos reguladores que controlam o desenvolvimento de pele e homeostase são mais comumente estudada em 2D usando o seccionamento de tecidos e coloração histológica ou rotulagem com anticorpos, que permite apenas uma apreciação restrito da morfologia da pele, populações de células ou a expressão da proteína. Um número de métodos foram desenvolvidos para melhorar a visualização da organização espacial das células e proteínas com uma resolução de uma única célula em 3 dimensões em peças inte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Australian Bio-Resources (Instituto Garvan, Austrália), o Centro de Recursos Biológicos (UNSW Austrália) e Animal Care & Comissão de Ética para o apoio à experimentação animal. Este trabalho foi financiado pelo Health and Medical Research Council Nacional da Austrália (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales é beneficiários de uma bolsa de estudos CONICYT-Becas Chile (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios é um receptor da Universidade Prêmio Internacional de Pós-Graduação por UNSW Austrália.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
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