İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Memeli kalp ATP önemli bir tüketici ve daralma enerji substratların sabit bir kaynağı gerektirir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, miyokard metabolizması değişiklikleri kasılma disfonksiyonu ve kalp yetmezliği gelişimine bağlantılı olmuştur. Bu nedenle, metabolizma ve daralma arasındaki bağlantıyı çözülüyor hastalık durumlarında kardiyak adaptasyon veya davranışsal sorunlar düzenleyen mekanizmaların bazıları da ışık tutmalıdır. çalışmakta olan sıçan kalbi hazırlığı aynı anda ve gerçek zamanda, kalp kasılma fonksiyonunun ve oksidatif metabolik yollar içinde alt-tabakaların temin enerji akı takip etmek için kullanılabilir. Mevcut protokol glikoz ve yağ asitleri, kalp substratlar sağlayan ana enerji oksidasyon oranları kantitatif ölçümü için tamponların hazırlanması ve kullanımında kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir açıklamasını sunmayı amaçlamaktadır. Örnek analizi ve veri yorumlama için kullanılan yöntemler de ele alınmıştır.Kısaca, bu teknik normotermik kristalloid perfüzyon yoluyla bir ex vivo dayak kalbe 14 arz C radyo-etiketli glukoz ve 3H-radyo-etiketli, uzun zincirli yağ asidi dayanır. 14 CO2 ile 3 H2O, son yan ürünleri bu enerji sağlayan alt-tabakaların kullanımına katılan enzimatik reaksiyonlar, ardından nicel koroner çıkış maddesinden geri kazanılır. kullanılan radyoaktif işaretli substratlar spesifik aktivitesi bilgisi ile, tek tek oksidasyon yolaklarında glükoz ve yağlı asit akışı ölçmek için mümkündür. izole edilmiş kalbin kasılma işlevi uygun kayıt cihazının paralel olarak belirlenir ve doğrudan metabolik akı değerleri ile ilişkili olabilir. teknik, öncesi ve yük ve iskemi, bir ilaç veya bir dolaşım sistemlerini sonra değişiklikler gibi çeşitli stres koşullarına cevaben metabolizma / daralma ilişkisini incelemek için son derece yararlıdırbir gen ürününün ekspresyonu değiştirilmesinden ting faktörü veya.
Introduction
klinik Alaka
Memeli kalbinde, oksidatif metabolik yollar, ATP üretimi ve kalp işi 1 ile substratların akı arasında güçlü bir pozitif ilişki vardır. Son yirmi yılda, kalp metabolizması ve fonksiyon arasındaki karmaşık bağlantı soruşturma kalp metabolizmasında değişiklikler kalp hastalığının 2-4 farklı türde ortamında kasılma disfonksiyon ve patolojik yapısal yeniden bir nedeni olduğunu fark yol açmıştır. nedenle, stresli kalp metabolik biçimlenme düzenleyen mekanizmaların anlaşılması, kalp yetmezliği, 5-7 önlenmesi ya da tedavisi için bir terapötik hedeflerin tanımlanmasına yol açacağı beklenmektedir. "Kardiyak Metabolizma Değerlendirilmesi" Amerikan Kalp Derneği bilimsel deyimi son yayın t bilimsel topluluğun artan ilgi vurgularAraştırmanın 8 onun alanı. Kardiyak görüntülemede teknolojik gelişmeler artık kardiyak morfoloji ve fonksiyon hızlı ve doğru bir değerlendirme için izin verirken Ancak, kalp metabolizması in vivo çalışma sınırlı ve külfetli kalır: Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi ve Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) görüntüleme can ex vivo olarak bu tarihten .To kararlı durum koşullarında oksidatif metabolizma çeşitli yüzeylerde katkısını 9 belirlemek için kalp yüksek enerji fosfat metabolizması ve Krebs döngüsü aktivitesini izlemek için kullanılabilir, ancak bu teknikler yüksek işletme maliyetleri ile ve kendi yetersizlik boğulmuş kalp hazırlık çalışma eş zamanlı ve gerçek zamanlı, oksidatif metabolik yollar 7,9 içine kasılma fonksiyonu ve substratların akı, çalışmak için tek ve benzersiz tekniği kullanılabilir temsil eder. Aşağıdaki protokol sıçan belirlemek için kullanılan reaktiflerin hazırlanması ve kullanımı yönergeleri sağlamayı amaçlarİzole çalışma sıçan kalbinde substratlar kullanım es.
İzole Çalışma Kemirgen Kalp Aparatı
teknik neredeyse yarım asırlık olmasına rağmen, izole çalışma sıçan kalp hazırlık kardiyovasküler araştırma için seçim yöntemi olmaya devam etmektedir. Langendorff kalp hazırlanması gibi, çalışma kemirgen kalp nörohormonal diğer organların ve diğer dolaşım faktörlerin karıştırıcı etkilerinden bağımsız olarak kalp parametreleri geniş bir yelpazede ölçmek için nispeten basit, güvenilir ve ucuz bir yol sağlar. Ancak Langendorff perfüze kalp aksine, çalışma kalp yakın fizyolojik kalp işi, in vivo koşullarında alakalı seviyelere oksidatif metabolik akışın üretilmesi için bir ön koşul yerine devam eder. Bu, sol atrium bağlı bir kanül aracılığı ile sol ventrikül (LV) perfüzyon tampon elde ederek ve AG, doldurur ve sözleşmeler gibidirtampon kararlı afterload hidrostatik basınca karşı aort hattı üzerinden çıkarılır. Başlangıçta 10 daha sonra Taegtmeyer, hems ve Krebs 11 tarafından geliştirilen, fakat Neely ve arkadaşları tarafından tarif edilen perfüzyon aparatı tasarımı zamandan beri çok az değişmiştir. Orijinal cihaz tarif edildiği gibi, kontraktil fonksiyon aort ölçmek için herhangi bir daha fazla dereceli silindirler ve bir kronometre kullanılarak kalp çıkışının saptanması yoluyla tespit edilebilir ve koroner 10,11 akar. Çeşitli satıcılar artık tam çalışma kemirgen kalp perfüzyon sistemleri sunuyoruz. Bu ticari olarak temin edilebilen bir düzen flowprobes, basınç gücü çeviricisi, bir basınç-hacim kateter ve kalp işlevsel veri alımı ve analizi için gerekli tüm ekipman ile elde edilebilir. satıcıları, kendi ekipman ile yeni bir kullanıcı tanımak için kapsamlı dokümantasyon ve eğitim oturumları sağlamak. çalışma kalp instrum birkaç da inceleme makaleleri detay protokollerientation ve kateter kullanımı ile ilgili kemirgenler 12-15 kardiyak fonksiyonunu ölçmek için. Bu nedenle, sadece kısa bir süre perfüzyon aparatı ve kayıt donanımları set-up değineceğim. Mevcut protokol yerine eş zamanlı olarak glikoz ve uzun zincirli yağ asidi oksidasyon oranları, normal kalpte iki büyük enerji sağlayan yüzeyler ölçmek için uygulanabilecek yöntemler bir açıklama ile zaten mevcut bilgiyi tamamlamayı amaçlamaktadır. Veri analizi, örneklerin kurtarma ve işleme reaktif ve tampon hazırlanmasından, miyokard oksidatif metabolizma değerlendirilmesi için radyoaktif işaretli enerji substratların kullanımı dahil burada tüm adımları açıklar.
Yönteminin İlkeleri
Kardiyomiyositlerde (glikoz yağ asidi (özellikle uzun zincirli yağ asidi) ve karbonhidrat oksidatif fosforilasyon ile ilgili daralma enerjilerinin bir kısmını oluştururE ve laktat). Kalp çok enerjik rezervleri sınırlı ve dolaşımdan bu enerji sağlayan substratların sürekli bir tedarik dayanmaktadır etti. glikolitik bir yol üzerinden glikoz katabolizması daha sonra iç mitokondriyal zarın piruvat dehidrojenaz kompleksi tarafından dekarboksile edilir piruvat elde edilir. albümin ya da lipoprotein trigliseritleri dolaşımdaki ekstre uzun zincirli yağlı asitler, ilk sitoplazmada asil-CoA moleküllere aktif ve daha sonra p-oksidasyon yolu girmek için karnitin transfer yoluyla mitokondrial matris içinde taşınmaktadır. Glukoz ve yağ asitlerinin katabolizması ile üretilen asetil CoA moleküller iç mitokondriyal membran boyunca proton motiv güç oluşturmak için elektron taşıma zinciri tarafından kullanılan indirgeyici eşdeğerleri (NADH ve FADH 2) oluşturmak için Krebs döngüsü yakıt ve ATP sentaz aktivitesi ile ATP üretir. Su ve karbondioksit sonu yan ürünleridirKrebs döngüsü içinde yer alan enzimatik reaksiyonlar. 14 C- ve 3H-radyo-etiketli substratlar tedarik çalışmakta olan kalp (örneğin, 14, C-radyo-etiketli glukoz ve 3-radyo işaretli oleik asit gibi), bunun sonucu olarak 14 CO 2 ve 3 H2O üretimine yol açacaktır olabilir kantitatif koroner atık geri kazanılabilir. 14 CO 2 koleksiyonu kapalı bir bölmeye izole perfüze kalbi tutarak ve kalbi çıkarken hemen koroner atık kurtarma tarafından yürütülmektedir. Küçük bir anyon değiştirme sütunu ayırmak ve koroner çıkış maddesinden 3 H2O kurtarmak için kullanılır. işlenmiş numuneler arasında radyoaktivite bir sıvı sintilasyon sayacı vasıtasıyla ölçüldü ve ikinci radyo-etiketli substratlar spesifik aktivitenin bilgisi ile birlikte, tek tek glukoz ve yağlı asit akışı ölçmek mümkün olur olanoksidasyon 16,17 yolaklarıyla.
Protocol
Representative Results
Discussion
önceki protokol aynı zamanda izole çalışma sıçan kalbinde glukoz oksidasyonu ve yağ asidi oksidasyon yoluyla substratın akı ölçmek için yöntemler göstermektedir. Ölçümler daha sonra (… vb iş yükü değişimi, iskemi-reperfüzyon) taban ve stres koşullarında yüzeyler metabolizma ve kalp çalışma arasındaki ilişkiyi belirlemek için kaydedilen kardiyak fonksiyonel parametrelere yerleştirilebilir. Metabolizma / daralma ilişkisi, kalp yetmezliği ve diyabet gibi önceden var olan koş…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
