طرق تقدير من معدلات الجلوكوز والأحماض الدهنية الأكسدة في عزل قلب الجرذ العمل
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
قلب الثدييات هو المستهلك الرئيسي للاعبي التنس المحترفين ويتطلب امدادات ثابتة من ركائز الطاقة للانكماش. ليس من المستغرب، وقد تم ربط التعديلات التمثيل الغذائي عضلة القلب في تطوير الخلل مقلص وفشل القلب. ولذلك، كشف الصلة بين التمثيل الغذائي وتقلص يجب تسليط الضوء على بعض الآليات التي تحكم التكيف القلب أو سوء التكيف في الحالات المرضية. العاملين إعداد قلب فأر معزولة يمكن استخدامها لمتابعة، في وقت واحد وفي الوقت الحقيقي، وظيفة مقلص القلب وتدفق الطاقة وتوفير ركائز في المسارات الأيضية المؤكسدة. ويهدف هذا البروتوكول إلى تقديم وصف مفصل للأساليب المستخدمة في إعداد واستخدام مخازن للقياس الكمي لمعدلات الأكسدة لالجلوكوز والأحماض الدهنية، والطاقة الرئيسية التي تقدم ركائز للقلب. وتناقش أيضا الأساليب المستخدمة لتحليل العينات وتفسير البيانات.وباختصار، يعتمد هذه التقنية على توريد 14 ج الجلوكوز رديولبلد و3 H- رديولبلد سلسلة طويلة من الأحماض الدهنية إلى خارج الجسم الحي القلب النابض عن طريق نضح شبه البلوري سوي الحرارة 14 CO 2 و 3 H 2 O، تركات نهاية التفاعلات الأنزيمية تشارك في الاستفادة من هذه ركائز توفير الطاقة، ثم يتم استردادها من الناحية الكمية من النفايات السائلة التاجي. مع المعرفة من نشاط معين من ركائز رديولبلد استخدامها، ومن ثم من الممكن ل quantitate بشكل فردي تدفق الجلوكوز والأحماض الدهنية في مسارات الأكسدة. وظيفة مقلص من القلب معزولة يمكن تحديد بالتوازي مع أجهزة التسجيل المناسبة وترتبط مباشرة بالقيم التمويه الأيضية. هذه التقنية مفيدة للغاية لدراسة العلاقة الأيض / انكماش في استجابة لظروف الإجهاد المختلفة مثل التغييرات في مرحلة ما قبل وبعد الحمل ونقص التروية، وهو دواء أو circulaعامل تينغ، أو بعد تغيير في التعبير عن الجين المنتج.
Introduction
أهمية سريرية
في قلب الثدييات، هناك علاقة إيجابية قوية بين تدفق ركائز من خلال المسارات الأيضية المؤكسدة، وتوليد ATP وعمل القلب 1. أدى التحقيق في الصلة المعقدة بين الأيض القلبية وظيفة على مدى العقدين الماضيين أن ندرك أن التغيرات في التمثيل الغذائي القلب هي سبب لضعف انقباض و إعادة هيكلية ربما المرضية في تحديد أنواع مختلفة من أمراض القلب 2-4. ولذلك، فإنه من المتوقع أن فهمنا للآليات التي تحكم إعادة التمثيل الغذائي للقلب وشدد سيؤدي إلى تحديد الأهداف العلاجية لمنع أو علاج قصور القلب 5-7. نشر مؤخرا بيانا علميا من جمعية القلب الأمريكية على "تقييم القلب الأيض" يؤكد الاهتمام المتزايد من جانب المجتمع العلمي لرحقله من الأبحاث 8. لكن في حين أن التقدم التكنولوجي في مجال التصوير القلبي تسمح الآن للتقييم الدقيق والسريع لالتشكل القلب وظيفة، لا تزال الدراسة في الجسم الحي الأيض القلب محدودة ومرهقة: يمكن الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي والنووي التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) التصوير يتم استخدامها لمتابعة القلب الطاقة العالية الفوسفات التمثيل الغذائي والنشاط دورة كريبس، ولكن تعاني هذه التقنيات من ارتفاع تكاليف التشغيل وعدم قدرتهم على تحديد مساهمة مختلف ركائز لالأيض المؤكسدة في ظروف الحالة المستقرة 9. لهذا التاريخ وخارج الجسم الحي العمل إعداد القلب يمثل تقنية الوحيدة والفريدة المتاحة للدراسة، في وقت واحد وفي الوقت الحقيقي، وظيفة مقلص وتدفق ركائز في المسارات الأيضية المؤكسدة 7،9. ويهدف البروتوكول التالية لتوفير مبادئ توجيهية في إعداد واستخدام الكواشف المستخدمة لتحديد الفئرانوفاق من استخدام ركائز في معزولة الفئران عمل القلب.
ومعزولة القوارض العمل القلب جهاز
على الرغم من أن الأسلوب هو قرن تقريبا نصف القديمة، ومعزولة العمل إعداد قلب فأر يبقى الأسلوب المفضل لأبحاث القلب والأوعية الدموية. كما هو الحال مع إعداد قلب Langendorff، قلب القوارض العمل يوفر وسيلة بسيطة نسبيا، يمكن الاعتماد عليها، وغير مكلفة لقياس مجموعة واسعة من المعلمات القلب بشكل مستقل عن آثار الخلط من الأجهزة الأخرى، الهرمونية العصبية والعوامل المتداولة الأخرى. ولكن على النقيض من القلب perfused Langendorff، لا يزال قلب العمل لأداء عمل القلب شبه الفسيولوجية، وهو شرط أساسي لتوليد تدفق الأيض التأكسدي إلى المستويات التي هي ذات الصلة إلى الأوضاع في الجسم الحي. ويتحقق ذلك من خلال تقديم العازلة نضح إلى البطين الأيسر (LV) عبر قنية مرتبطة إلى الأذين الأيسر، وكما يملأ LV والعقود، ويتم إخراج عازلة من خلال خط الأبهر ضد بعد التحميل الضغط الهيدروليكي العزم. تصميم جهاز نضح وصف في الأصل من قبل نيلي وزملاؤه 10 وتحسنت فيما بعد Taegtmeyer، حمص وكريبس 11، ولكن لم يتغير سوى القليل جدا منذ ذلك الحين. كما هو موضح في الجهاز الأصلي، وظيفة مقلص يمكن تقييمه من خلال تحديد النتاج القلبي، وذلك باستخدام أي أكثر من أسطوانة مدرجة وساعة توقيت لقياس الأبهر وتدفقات التاجي 10،11. عدة بائعين تقدم الآن أنظمة كاملة القوارض العمل نضح القلب. يمكن الحصول على هذه الأجهزة متوفرة تجاريا مع flowprobes، محولات الضغط، قسطرة حجم الضغط وجميع المعدات اللازمة للحصول على البيانات وظيفي في القلب والتحليل. توفر البائعين جلسات الوثائق وتدريبية مكثفة لتعريف المستخدم الجديد مع معداتهم. عدة مقالات المراجعة أيضا بروتوكولات التفاصيل عن instrum قلب العملentation وعلى استخدام القسطرة لقياس وظيفة القلب لدى القوارض 12-15. لهذا السبب، فإننا سوف أذكر فقط لفترة وجيزة على انشاء الجهاز نضح وأجهزة التسجيل. ويهدف هذا البروتوكول إلى حد ما تكمل المعلومات المتاحة بالفعل مع وصف الأساليب التي يمكن تنفيذها لقياس الوقت نفسه معدلات الجلوكوز وسلسلة طويلة للأكسدة الأحماض الدهنية، وهما توفير الطاقة ركائز رئيسية في القلب الطبيعي. وصفنا هنا كل الخطوات المتبعة في استخدام الطاقة ركائز رديولبلد لتقييم عملية التمثيل الغذائي الناتج عن الأكسدة عضلة القلب، من إعداد الكواشف ومخازن للانتعاش وتجهيز العينات، لتحليل البيانات.
مبادئ الطريقة
العضلية تولد معظم طاقتها لتقلص من الفسفرة التأكسدية من الأحماض الدهنية (أساسا الأحماض الدهنية طويلة السلسلة) والكربوهيدرات (glucosه واللاكتات). قلب محدودة جدا احتياطيات الطاقة وتعتمد على إمدادات ثابتة من هذه ركائز توفير الطاقة من الدورة الدموية. وهدم الجلوكوز من خلال مسار حال السكر ينتج البيروفات التي يتم بعد ذلك decarboxylated من قبل مجمع نازعة البيروفات للغشاء الميتوكوندريا الداخلية. الأحماض الدهنية طويلة السلسلة، المستخرجة من تعميم الزلال أو البروتين الدهني الدهون الثلاثية، وتنشيط أولا إلى جزيئات أسيل، لجنة الزراعة في العصارة الخلوية ونقل بعد ذلك داخل المصفوفة الميتوكوندريا من خلال المكوك الكارنيتين لدخول مسار بيتا للأكسدة. جزيئات أسيتيل جنة الزراعة التي تنتجها هدم الجلوكوز والأحماض الدهنية تغذي دورة كريبس لتوليد حكمه الحد (NADH والقوات المسلحة الهايتية 2) والتي تستخدم من قبل في سلسلة نقل الإلكترون لبناء قوة البروتون الدافع عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية و توليد ATP من خلال نشاط سينسيز اعبي التنس المحترفين. الماء وثاني أكسيد الكربون والمنتجات الثانوية نهايةالتفاعلات الأنزيمية التي تجري داخل دورة كريبس. توريد 14 ج و 3 H- ركائز رديولبلد (مثل 14 الجلوكوز C-رديولبلد وحمض الأوليك 3 H-رديولبلد) إلى قلب العمل معزولة سيؤدي بالتالي إلى إنتاج 14 CO 2 و 3 H 2 O التي يمكن سيتم استردادها من الناحية الكمية من النفايات السائلة التاجي. ويتم جمع 14 CO 2 عن طريق الحفاظ على القلب perfused معزولة في غرفة مغلقة ويتعافى على الفور النفايات السائلة التاجي فور خروجها من القلب. ويستخدم عمود الصرف أنيون صغير لفصل واستعادة 3 H 2 O من النفايات السائلة التاجي. يتم قياس النشاط الإشعاعي من العينات المصنعة مع عداد التلألؤ السائل، ومطلع على نشاط معين من ركائز رديولبلد استخدامها، ومن ثم من الممكن ل quantitate بشكل فردي تدفق الجلوكوز والأحماض الدهنية فيالأكسدة مسارات 16،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل البروتوكول السابق الطرق لتحديد وقت واحد تدفق الركيزة عن طريق الأكسدة الجلوكوز وأكسدة الأحماض الدهنية في الفئران المعزولة عمل القلب. ويمكن بعد ذلك القياسات يتم فرضه على المعلمات الوظيفية القلب المسجلة لتحديد العلاقة بين ركائز عملية التمثيل الغذائي وعمل القل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
