Metoder til bestemmelse af priser for glucose og fedtsyreoxidation i Isolated Working Rat Heart

Summary

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Abstract

Den pattedyr hjerte er storforbruger af ATP og kræver en konstant tilførsel af energi substrater til sammentrækning. Ikke overraskende har ændringer af myocardial metabolisme været knyttet til udviklingen af ​​kontraktil dysfunktion og hjertesvigt. Derfor optrevling sammenhængen mellem metabolisme og sammentrækning skal kaste lys over nogle af de mekanismer, der styrer hjerte-tilpasning eller dårlig tilpasning i sygdomstilstande. Det isolerede rotte hjerte præparat arbejder kan bruges til at følge, samtidig og i realtid, hjerte- kontraktile funktion og flux af energi leverer substrater til oxidative metaboliske veje. Den nuværende protokol til formål at give en detaljeret beskrivelse af de metoder, der anvendes til fremstilling og anvendelse af buffere til kvantitativ måling af satserne for oxidation for glucose og fedtsyrer, den vigtigste energi leverer substrater af hjertet. De til prøveanalyse og datafortolkning metoder er også diskuteret.Kort fortalt er teknikken baseret på levering af ¹⁴ C- radiomærket glucose og en ^{3H-radiomærket} langkædet fedtsyre til en ex vivo bankende hjerte via normotermisk krystalloid perfusion. ¹⁴ CO ₂ og ³ _H2O, endelige biprodukter af de enzymatiske reaktioner, der er involveret i udnyttelsen af ​​disse energi leverer substrater, derefter kvantitativt genvindes fra koronar spildevand. Med kendskab til den specifikke aktivitet af de radiomærkede anvendte substrater, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af ​​glucose og fedtsyre ved oxidationen veje. Kontraktile funktion af det isolerede hjerte kan bestemmes parallelt med den passende kontrolapparatet og direkte korreleret til metaboliske flux værdier. Teknikken er yderst nyttig til at studere metabolismen / sammentrækning forhold som reaktion på forskellige stressbetingelser såsom ændringer i før og efter belastning og iskæmi, et lægemiddel eller et omløbTing faktor, eller efter ændring i ekspressionen af ​​et gen produkt.

Introduction

Klinisk relevans

I pattedyrs hjerte, er der en stærk positiv sammenhæng mellem fluxen af substrater gennem oxidative metaboliske veje, ATP generation og hjertets arbejde ^1. I de seneste to årtier, har undersøgelsen af den indviklede sammenhæng mellem hjerte-stofskifte og funktion førte til at erkende, at ændringer i hjertets stofskifte er en årsag til kontraktile dysfunktion og eventuelt patologisk strukturelle remodeling i fastsættelsen af forskellige typer af hjertesygdomme ^2-4. derfor forventes det, at vores forståelse af de mekanismer, der styrer metaboliske ombygning af stressede hjerte vil føre til identifikation af terapeutiske mål for forebyggelse eller behandling af hjertesvigt ^5-7. Den nylige offentliggørelse af en videnskabelig redegørelse fra American Heart Association på "Vurdering Cardiac Metabolisme" understreger den voksende interesse for det videnskabelige samfund for thans forskningsfelt ^8. Men mens de teknologiske fremskridt i cardiac imaging nu mulighed for en hurtig og præcis vurdering af hjertefunktionen morfologi og funktion, in vivo-undersøgelse af hjertets stofskifte fortsat begrænset og byrdefuld: kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og Positron Emission Tomography (PET) scanning kan anvendes til at følge cardiac høj energi phosphatmetabolisme og Krebs cyklus aktivitet, men disse teknikker er plaget af høje driftsomkostninger og ved deres manglende evne til at bestemme bidraget fra forskellige substrater for oxidativ metabolisme i ligevægtsforhold ⁹ .For denne dato ex vivo arbejder hjerte forberedelse repræsenterer den eneste og unikke teknik til rådighed til at studere, samtidigt og i realtid, kontraktil funktion og flux af substrater til oxidative metaboliske veje ^7,9. Følgende protokol til formål at give retningslinjer i forberedelsen og udnyttelsen af ​​reagenser bruges til at bestemme rottenes af substrater udnyttelse i den isolerede arbejdsmiljø rotte hjerte.

De isolerede Working gnaver Heart Apparatur

Selvom teknikken er næsten et halvt århundrede gamle, det isolerede rottehjerte præparat arbejder stadig et foretrukne metode til kardiovaskulær forskning. Som med Langendorff hjerte forberedelse, arbejdsmiljøet gnaver hjertet tilbyder en relativt simpel, pålidelig og billig måde at måle en bred vifte af hjerteparametre uafhængigt af de forstyrrende virkninger af andre organer, neurohormonale og andre cirkulerende faktorer. Men i modsætning til Langendorff-perfunderet hjerte, arbejdsmiljøet hjertet fortsætter med at udføre næsten fysiologisk hjertets arbejde, en forudsætning for dannelsen af oxidative metaboliske flux til niveauer, der er relevante for in vivo betingelser. Dette opnås ved at levere perfusionen buffer til den venstre ventrikel (LV) via en kanyle forbundet til det venstre atrium, og som LV fylder og udbud, enbuffer udstødes gennem aorta linje mod et bestemt afterload hydrostatisk tryk. Udformningen af perfusion apparat oprindeligt beskrevet af Neely og kolleger ¹⁰ blev efterfølgende forbedret ved Taegtmeyer, Hems og Krebs ^11, men har ændret sig meget lidt siden da. Som beskrevet i den oprindelige apparat, kan kontraktile funktion vurderes ved bestemmelse af minutvolumen, hjælp ikke flere end graduerede cylindre og et stopur til at måle aorta og koronar strømme ^10,11. Flere leverandører nu tilbyde komplette arbejdsmiljø gnaver hjerte perfusion systemer. Disse kommercielt tilgængelige apparater kan erhverves med flowprobes, tryktransducere, et tryk-volumen kateter og alt det nødvendige udstyr til hjerte-funktionel indsamling og analyse af data. Sælgerne giver omfattende dokumentation og kurser til at sætte den nye bruger med deres udstyr. Adskillige oversigtsartikler også detaljer protokoller om arbejdsmiljøet hjerte instrumentation og om brugen af katetre til måling hjertefunktion hos gnavere ^12-15. Derfor vil vi kun kort nævne det set-up af perfusion apparater og kontrolapparatet. Den nuværende protokol snarere har til formål at supplere de allerede tilgængelige oplysninger med en beskrivelse af de metoder, der kan gennemføres til samtidig satserne for glucose og langkædede fedtsyrer oxidation, de to store energi leverer substrater i normal hjerte. Vi beskriver her alle de trin, der er involveret i brugen af ​​radioaktivt mærkede energi substrater til vurdering af myokardie oxidativ metabolisme, fra udarbejdelse af reagenser og buffere til genopretning og behandling af prøver, til dataanalyse.

Principper for metoden

Cardiomyocytter generere hovedparten af ​​deres energi til kontraktion fra den oxidative phosphorylering af fedtsyrer (hovedsageligt langkædede fedtsyrer) og carbohydrater (glucose og lactat). Hjertet har meget begrænset energiske reserver og er afhængig af en konstant tilførsel af disse energi leverer substrater fra cirkulationen. Katabolismen af ​​glucose gennem den glycolytiske pathway giver pyruvat, som derefter decarboxyleres ved pyruvatdehydrogenase-kompleks af den indre mitokondrielle membran. Langkædede fedtsyrer, udvundet af cirkulerende albumin eller lipoprotein triglycerider, først aktiveres til acyl-CoA-molekyler i cytosolen og derefter transporteres inde i mitochondriematricen gennem carnitin shuttle at indtaste beta-oxidation pathway. Acetyl-CoA molekyler fremstillet ved katabolismen af glucose og fedtsyrer brændstof Krebs cyklus til at generere de reducerende ækvivalenter (NADH og FADH _2), der anvendes af elektrontransportkæden at bygge proton-motorkraft tværs den indre mitokondrielle membran og generere ATP gennem aktiviteten af ​​ATP syntase. Vand og kuldioxid er de endelige biprodukter afde enzymatiske reaktioner, der finder sted inde i Krebs cyklus. Levering af ¹⁴ C- og ^{3H-radioaktivt} mærkede substrater (såsom ^{14C-radiomærket} glucose og ^{3H-radiomærket} oliesyre) til isolerede arbejder hjerte vil følgelig føre til produktion af ¹⁴ CO ₂ og ³ _H2O, som kan kvantitativt udvindes fra koronar spildevand. Indsamlingen af ¹⁴ CO ₂ udføres ved at holde den isoleret perfunderet hjerte i en forseglet kammer og ved straks udvinding af koronar spildevand, idet den forlader hjertet. En lille anionbyttersøjle bruges til at adskille og genvinde ³ _H2O fra koronar spildevand. Radioaktiviteten af ​​de behandlede prøver måles med en væskescintillationstæller, og med kendskab til den specifikke aktivitet af radioaktivt mærkede substrater anvendes, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af ​​glucose og fedtsyre ioxidation veje ^16,17.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med NIH Public Health Service Politik på Human Care og anvendelse af dyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Mississippi Medical Center. Alle procedurer, der involverer brugen af ​​radioaktive isotoper blev godkendt og udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af stråling sikkerhed kontor på University of Mississippi Medical Center. 1. Udarbejdelse af Stock Buffer …

Representative Results

To repræsentative eksperimenter er beskrevet i nedenstående figurer. I begge tilfælde blev hjertet af en 16 uger gamle Sprague Dawley rotte isoleret og perfunderet i arbejds- tilstand med KH-buffer fremstillet ifølge det foregående protokol. I hvert forsøg blev hjertet udsat for en stresstilstand påvirker hjertes arbejde. Cardiac kontraktile funktion blev bedømt ved kontinuerlig registrering af puls tryk gennem indsættelse af en tryktransducer i aorta linje og ved bestemmelse af…

Discussion

Den foregående protokol beskriver de metoder til samtidig kvantificering fluxen af ​​substratet gennem glucose oxidation og fedtsyreoxidation i det isolerede arbejdsdag rotte hjerte. Målingerne kan derefter oven på de optagne cardiac funktionelle parametre for at bestemme forholdet mellem substrater stofskifte og hjerte arbejde under baseline og stress betingelser (ændring i arbejdsbyrden, iskæmi-reperfusion, etc …). Det er også muligt at vurdere, hvordan stofskiftet / sammentrækning forhold påvir…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)	Fisher Scientific	M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific	S233
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g	Bio-Rad	1401441	This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g	Bio-Rad	1432445	Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder	Fisher Scientific	09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318	Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder	Fisher Scientific	11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	EMD Millipore	820027	We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate	Sigma-Aldrich	O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-	PerkinElmer	NET289005MC	Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter	Fisher Scientific	08-667E
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glucose, D-[14C(U)]-	PerkinElmer	NEC042B005MC	Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100	Eli Lilly and Company	NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate	Sigma-Aldrich	T133	Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid	Roboz Surgical	SUT-15-3
10X Hyamine Hydroxide	PerkinElmer	6003005	Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 mL Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-341-25E	Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 mL HDPE Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-337-23B	Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers	Fisher Scientific	14-126DD	Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm	BD	305194	Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60%	Fisher Scientific	A228	Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail	PerkinElmer	6013327
Glass Wool	Fisher Scientific	AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder	Fisher Scientific	04-355	For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent	Fisher Scientific	16-000-115	For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue