Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Het zoogdierhart worden grote hoeveelheden van ATP en vereist een constante toevoer van energie substraten voor contractie. Niet verrassend, hebben veranderingen van myocardiale metabolisme gekoppeld aan de ontwikkeling van contractiele dysfunctie en hartfalen. Daarom is het ontrafelen van het verband tussen de stofwisseling en krimp moet licht werpen op een aantal van de mechanismen die cardiale aanpassing of maladaptatie bij de ziekte van staten. De geïsoleerde werkende rattehart preparaat kan worden gebruikt om te volgen, gelijktijdig en in real time, contractiele functie en de stroom van energie verschaffen substraten in oxidatieve metabole routes. De onderhavige protocol beoogt een gedetailleerde beschrijving van de bij de bereiding en het gebruik van buffers voor de kwantitatieve meting van de snelheden van oxidatie van glucose en vetzuren, de belangrijkste energiebron verschaffen substraten van het hart werkwijzen. De voor monsteranalyse en data interpretatiemethodes worden besproken.In het kort, is de techniek waarbij de levering van 14 C- radiolabeled glucose en 3 H- radiolabeled lange keten vetzuur een ex vivo kloppend hart via normotherme kristalloïde perfusie. 14 CO 2 en 3 H 2 O, einde van bijproducten de enzymatische reacties die betrokken zijn bij het gebruik van deze energie leveren substraten, worden vervolgens kwantitatief teruggewonnen uit de coronaire effluent. Met kennis van de specifieke activiteit van het radioactief gemerkte substraten gebruikt, is het dan mogelijk om afzonderlijk kwantificeren de flux van glucose en vetzuur in de oxidatie trajecten. Contractiele functie van het geïsoleerde hart kan worden bepaald in overeenstemming met de desbetreffende controleapparaat en is rechtstreeks gecorreleerd met metabole flux waarden. De techniek is bijzonder nuttig voor het metabolisme / contractie verhouding naar aanleiding van verschillende stress-omstandigheden te bestuderen zoals veranderingen in voor en na belasting en ischemie, een geneesmiddel of een omloopting factor of na de verandering van de expressie van een genproduct.
Introduction
klinische relevantie
In het zoogdierhart, is er een sterk positief verband tussen de flux van substraten door middel van oxidatieve metabolische wegen, ATP productie en cardiale 1. In de afgelopen twee decennia is het onderzoek van de ingewikkelde relatie tussen de cardiale metabolisme en functie leidde om te erkennen dat veranderingen in cardiale metabolisme zijn een reden tot contractiele dysfunctie en mogelijk pathologische structurele remodeling in de setting van verschillende vormen van hart-en vaatziekten 2-4. daarom wordt verwacht dat ons begrip van de mechanismen die metabolische remodellering van de stressed hart zal leiden tot de identificatie van therapeutische doelen voor het voorkomen of behandelen van hartfalen 5-7. De recente publicatie van een wetenschappelijke verklaring van de American Heart Association over "Het beoordelen van Cardiac Metabolism", benadrukt de groeiende belangstelling van de wetenschappelijke gemeenschap voor tZijn onderzoeksgebied 8. Maar terwijl de technologische vooruitgang in cardiale beeldvorming nu die een snelle en nauwkeurige evaluatie van cardiale morfologie en functie, de in vivo cardiaal metabolisme blijft beperkt en omslachtig: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie en Positron Emissie Tomografie (PET) beeldvorming kan worden gebruikt voor cardiale adenosinetrifosfaat metabolisme en Krebs cyclus activiteit volgen, maar deze technieken worden geplaagd door hoge exploitatiekosten en hun onvermogen om de bijdrage van verschillende substraten voor oxidatieve metabolisme in evenwichtstoestand 9 .Om dit tijdstip het ex vivo bepalen werkend hart voorbereiding vertegenwoordigt de enige en unieke techniek beschikbaar om te studeren, gelijktijdig en in real time, contractiele functie en de flux van substraten in oxidatieve metabole routes 7,9. Het volgende protocol is bedoeld om richtlijnen bij de voorbereiding en het gebruik van de reagentia gebruikt om de ratten te kunnen bepalenes substraten benutting in het geïsoleerde werkende rat hart.
De geïsoleerde Working Knaagdieren Heart Apparatus
Hoewel de techniek is bijna een halve eeuw oud, het geïsoleerde werkende rat hart voorbereiding blijft een methode van de keuze voor cardiovasculair onderzoek. Zoals met de Langendorff hartsvoorbereiding, de werkende hart knaagdier biedt een relatief eenvoudige, betrouwbare en goedkope manier om een breed scala van cardiale parameters onafhankelijk meten van de verstorende effecten van andere organen, neurohormonale en andere circulerende factoren. Maar in tegenstelling tot de Langendorff-geperfuseerde hart de werkende hart blijft nagenoeg fysiologische cardiale, een voorwaarde voor de vorming van oxidatieve metabole flux tot een niveau dat in vivo omstandigheden relevant zijn uitgevoerd. Dit wordt bereikt door het leveren van de perfusie buffer naar de linker ventrikel (LV) via een canule verbonden met het linker atrium, en de LV vult en contracten,buffer wordt uitgestoten door de aorta lijn tegen een bepaalde afterload hydrostatische druk. Het ontwerp van de perfusie apparaat oorspronkelijk beschreven door Neely en collega's 10 werd vervolgens verbeterd door Taegtmeyer, Hems en Krebs 11, maar is sindsdien weinig veranderd. Zoals beschreven in de oorspronkelijke inrichting, contractiele functie kan worden beoordeeld aan de bepaling van hartminuutvolume behulp maximaal maatcilinders en een stopwatch meten aorta en coronaire stromen 10,11. Verschillende leveranciers bieden nu compleet werkend knaagdier hart perfusie systemen. Deze commercieel verkrijgbare apparaat kan met flowprobes, druk transducers, een druk-volume katheter en al het nodige voor cardiale functionele data-acquisitie en analyse-apparatuur worden aangeschaft. De leveranciers bieden uitgebreide documentatie en trainingen aan de nieuwe gebruiker met hun apparatuur vertrouwd te maken. Diverse overzichtsartikelen ook detail protocollen op de werkende hart instrumentatie en het gebruik van katheters hartfunctie bij knaagdieren 12-15 te meten. Om deze reden zullen wij slechts kort melding van de set-up van de perfusie apparaat en het controleapparaat. Dit protocol plaats beoogt de reeds beschikbare informatie te vullen met een beschrijving van de methoden die kunnen worden toegepast om gelijktijdig de snelheden van glucose en lange-keten vetzuur oxidatie, de twee belangrijkste energie verschaffen substraten in het normale hart. We beschrijven hier alle stappen bij het gebruik van radioactief gemerkte energiesubstraten voor het meten van myocard oxidatieve metabolisme, van de bereiding van reagentia en buffers voor het ophalen en verwerken van monsters voor de gegevensanalyse.
Principes van de methode
Cardiomyocyten het vaakst worden hun energie voor contractie van de oxidatieve fosforylering van vetzuren (hoofdzakelijk langketenige vetzuren) en koolhydraten (glucose en lactaat). Het hart heeft zeer beperkte energetische reserves en voert een constante toevoer van deze energie verschaffen substraten uit de circulatie. De afbraak van glucose door de glycolytische weg pyruvaat oplevert dat vervolgens wordt gedecarboxyleerd door het pyruvaat dehydrogenase complex van de binnenste mitochondriale membraan. Lange-keten vetzuren, geëxtraheerd uit circulerende lipoproteïnen albumine of triglyceriden, worden eerst geactiveerd in acyl-CoA moleculen in het cytosol en vervolgens in de mitochondriale matrix getransporteerd door de carnitine shuttle naar de beta-oxidatie route voeren. Acetyl-CoA moleculen geproduceerd door de afbraak van glucose en vetzuren brandstof de Krebs cyclus de reducerende equivalenten (NADH en FADH 2) die worden gebruikt door de elektron transport keten de proton-motive force in het binnenste mitochondriale membraan bouwen genereren en genereren van ATP door de activiteit van de ATP synthase. Water en kooldioxide eind van bijproductende enzymatische reacties die plaatsvinden in de Krebs cyclus. De toevoer van 14 C- en 3H-radioactief gelabelde substraten (zoals 14 C-radioactief gemerkt glucose en 3H-radioactief gemerkt oliezuur) aan de geïsoleerde werkende hart zal derhalve leiden tot de productie van 14 CO 2 en 3 H 2 O die kan kwantitatief worden teruggewonnen uit de coronaire effluent. De collectie van 14 CO 2 wordt uitgevoerd door het bijhouden van de geïsoleerde doorbloed hart in een afgesloten kamer en door onmiddellijk te herstellen van de coronaire effluent zodra ze uit het hart uitgevoerd. Een kleine anionenuitwisselingskolom wordt gebruikt te scheiden en terug 3 H 2 O van de coronaire effluent. De radioactiviteit van de verwerkte monsters wordt gemeten met een vloeistofscintillatieteller, en met kennis van de specifieke activiteit van het radioactief gemerkte substraten gebruikt, is het dan mogelijk om afzonderlijk kwantificeren de flux van glucose en vetzuur in hetoxidatie trajecten 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voorgaande protocol beschrijft de methoden om tegelijkertijd de flux van substraat te kwantificeren door middel van glucose oxidatie en vetzuur oxidatie in het geïsoleerde werkende rat hart. De metingen kunnen vervolgens worden gesuperponeerd op de geregistreerde cardiale functionele parameters de verhouding tussen substraten metabolisme en cardiale werken onder basislijn en stress factoren (verandering in belasting, ischemie-reperfusie, enz …). Het is ook mogelijk om te evalueren hoe het metabolisme / c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
