שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
הלב היונק הוא צרכני גדולה של ATP ודורש אספקה קבועה של מצעי אנרגיה להתכווצות. באופן לא מפתיע, שינויים של חילוף החומרים בשריר הלב קושרו להתפתחות של ליקוי התכווצות ואי ספיקת לב. לכן, לפרום את הקשר בין מטבוליזם והתכווצות צריך לשפוך אור על כמה מן המנגנונים השולטים הסתגלות לב או maladaptation במדינות מחלה. הכנת לב עכברוש המבודדת עובדת יכולה לשמש כדי לעקוב אחר, בו זמני ובזמן אמת, פונקצית התכווצות לב שטף של אנרגית מתן מצעים לתוך מסלולי מטבוליים חמצונים. הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות בהכנה וסילוק מאגרים למדידת כמותית של שיעורי חמצון עבור הגלוקוז וחומצות שומן, האנרגיה העיקרית בו תינתן מצעים של הלב. השיטות השונות שהופעלו לניתוח מדגם נתונים לפרשנות גם הם דנו.קיצורו של דבר, הטכניקה מבוססת על אספקת 14 C- גלוקוז רדיואקטיבי וכן 3 H- חומצת שומן ארוכת שרשרת רדיואקטיבי אל הלב הפועם vivo לשעבר דרך זלוף גְבִישָׁן normothermic. 14 CO 2 ו -3 H 2 O, תוצרי לוואי סוף התגובות האנזימטית המעורבות בניצול מצעי מתן אלה אנרגיה, הם התאוששו באופן כמותי מן השפכים כלילית. עם ידע של הפעילות הספציפית של המצעים רדיואקטיבי בשימוש, אז זה ניתן בנפרד לכמת את השטף של גלוקוז וחומצה שומני מסלולי החמצון. פונקצית התכווצות של הלב המבודד ניתן לקבוע במקביל ציוד ההקלטה המתאים ו בקורלציה ישירות לערכי שטף מטבולית. טכניקה זו שימושית מאוד ללמוד את הקשר מטבוליזם / התכווצות בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון שינויים טרום ואחרי עומס איסכמיה, תרופה או circulaגורם טינג, או בעקבות שינוי בביטוי של תוצר הגן.
Introduction
רלוונטי קליני
בלב היונק, קיים קשר חיובי חזק בין השטף של מצעים דרך מסלולי מטבוליים חמצונים, דור ה- ATP ו -1 עבודת לב. במהלך שני העשורים האחרונים, חקירת הקישור המורכב בין מטבוליזם לב והתפקוד הובילה להכיר כי השינויים במטבוליזם לב הן גורמות לטיפול באין התכווצות ואולי שיפוץ מבני פתולוגיים את ההגדרה של סוגים שונים של מחלות לב 2-4. לכן, צפוי כי הבנתנו את המנגנונים השולטים שיפוץ המטבולית של הלב הדגיש תוביל לזיהוי מטרות טיפוליות למניעה או לטיפול באי ספיקת לב 5-7. הפרסום האחרון של קביעה מדעית מן איגוד הלב האמריקאי על "הערכת מטבוליזם לב" מדגיש את העניין הגובר של הקהילה המדעית לאבתחום המחקר שלו 8. אבל בעוד ההתקדמות הטכנולוגית בתחום ההדמיה הלב עכשיו לאפשר הערכה מדויקת ומהירה של מורפולוגיה לב ותפקוד, המחקר in vivo של מטבוליזם הלב נשאר מוגבל ומכבידות: תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) ו טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) יכול הדמיה להשתמש כדי לעקוב אחר מטבוליזם פוספט גבוה אנרגית לב ופעילות מחזור קרבס, אבל טכניקות אלה הם הטרידו עלויות תפעול גבוהות ועל ידי חוסר היכולת שלהם לקבוע את התרומה של מצעים שונים כדי מטבוליזם חמצונים בתנאים יציבים 9 .כדי למועד זה vivo לשעבר עבודה הכנה הלב מייצג את הטכניקה היחידה וייחודי לטובת לימודים, בו זמנית ובזמן אמת, הפונקציה התכווצות ושטף של מצעים לתוך מסלולים מטבוליים חמצוני 7,9. הפרוטוקול הבא נועד לספק הנחיות בהכנה וסילוק חומרים כימיים המשמשת לקביעת העכברושes של ניצול מצעים בלב עכברוש עבודה המבודד.
מנגנון הלב המבודד עבודה המכרסמת
למרות הטכניקה היא כמעט בן חצי מאה, הכנת לב עכברוש המבודדת עובדת נשארת שיטת הבחירה של מחקר לב וכלי דם. כמו במקרה של הכנת לב Langendorff, בלב מכרסמי עבודה מציע דרך פשוטה יחסית, אמינה, ולא יקרה כדי למדוד מגוון רחב של פרמטרי לב במנותק תופעות הבלבול של איברים אחרים, neurohormonal וגורם במחזור שני. אלא שבניגוד בלב-perfused Langendorff, בלב העבודה ממשיך לבצע עבודת לב הכמעט פיזיולוגית, דרישה מוקדמת עבור הדור של שטף מטבולים של חמצון לרמות שרלוונטיות תנאי in vivo. זו מושגת על ידי מתן למאגר זלוף אל החדר השמאלי (LV) באמצעות צינורית מחובר הפרוזדור השמאלי, וככל LV מילויי חוזים,החיץ נפלט דרך קו אב העורקים כנגד לחץ ההידרוסטטי afterload נחוש. העיצוב של מנגנון זלוף תאר במקור על ידי ונילי ועמיתיו 10 השתפרו לאחר מכן על ידי Taegtmeyer, אמרות שמלות וקרבס 11, אבל השתנה מעט מאוד מאז. כפי שתואר במנגנון המקורי, הפונקציה התכווצות ניתן להעריך באמצעות קביעת תפוקת הלב, באמצעות לא יותר משורה ו סטופר למדוד אבי העורקים הכליליים זורם 10,11. מספר ספקים מציעים כעת מערכות זלוף הלב מכרסם עבודה מלאה. ניתן לרכוש מסחרית אלה מנגנון זמין עם flowprobes, מתמרים ללחץ, קטטר לחץ-נפח וכל הציוד הדרוש לרכישת נתונים תפקודית לב וניתוח. הספקים לספק הפעלות תיעוד והכשרה מקיפות להכיר המשתמש החדש עם הציוד שלהם. מאמרי ביקורת אחדים גם פרוטוקולים בפירוט על instrum הלב עובדentation ועל השימוש צנתרים למדוד תפקוד הלב במכרסמים 12-15. מסיבה זו, אנו בקצרה רק לדבר על ההגדרה של מנגנון זלוף וציוד ההקלטה. הפרוטוקול הנוכחי דווקא שואפת להשלים את המידע שכבר זמין עם תיאור של שיטות שניתן ליישם בו זמנית למדוד את שיעורי גלוקוז וחמצון חומצות שומן ארוכות שרשרת, שני מצעים לספק אנרגיה מרכזי בלב נורמלי. אנו מתארים כאן את כל השלבים הכרוכים בשימוש מצעים אנרגיה radiolabeled להערכת מטבוליזם חמצוני שריר הלב, מן ההכנה של ריאגנטים מאגרים להתאוששות ועיבוד של דגימות, לניתוח נתונים.
עקרונות השיטה
Cardiomyocytes ליצור את חלק הארי של האנרגיה שלהם התכווצות מן זרחון חמצוני של חומצות שומן (חומצות שומן ארוכות שרשרת בעיקר) ופחמימות (glucosדואר ומיניקות). הלב מאוד מוגבל עתודות אנרגטיות מסתמך על אספקה סדירה של מצעי מתן אלה אנרגיה מהמחזור. פירוק של גלוקוז דרך מסלול glycolytic מניב פירובט אשר decarboxylated מכן על ידי מורכבות פירובט דהידרוגנאז של קרום המיטוכונדריה הפנימית. חומצות שומן ארוכות שרשרת, המופק במחזור טריגליצרידים אלבומין או ליפופרוטאין, מופעלים הראשון למולקולות acyl-CoA reductase ב cytosol ובהמשך מועבר בתוך מטריקס המיטוכונדריה דרך הסעות קרניטין להיכנס מסלול-חמצון בטא. המולקולות-CoA אצטיל המיוצרות על ידי הפירוק של הגלוקוז וחומצות שומן לתדלק במעגל קרבס על מנת ליצור את ושווי הצמצום (NADH ו FADH 2) אשר נמצאים בשימוש על ידי שרשרת העברת אלקטרונים לבנות את כוח פרוטון-המניע פני קרום המיטוכונדריה הפנימי ליצור ATP דרך הפעילות של ה- ATP synthase. מים ופחמן דו חמצני הם תוצרי לוואי הסוףהתגובות האנזימטית המתרחשות בתוך במעגל קרבס. אספקת 14 C- ו -3 H- מצעים רדיואקטיבי (כגון 14 גלוקוז C-רדיואקטיבי ו -3 H-רדיואקטיבי חומצה אולאית) ללב עובד מבודד וכתוצאה מכך יוביל לייצור 14 CO 2 ו -3 H 2 O אשר יכול להיות התאושש כמותית מן השפכים כלילית. האוסף של 14 CO 2 מתבצע על ידי שמירה על לב perfused מבודד לתוך תא אטום על ידי מייד לשחזר את השפכים כלילית עם יציאתו בלב. טור אניוני קטן משמש להפריד ולשחזר 3 H 2 O מן השפכים כלילית. רדיואקטיביות ממדגמים המעובד נמדדת עם מונה נצנץ נוזלי, ועם ידע של הפעילות הספציפית של המצעים רדיואקטיבי בשימוש, אז זה ניתן בנפרד לכמת את השטף של גלוקוז וחומצה שומניחמצון מסלולי 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הקודם מפרט את שיטות לכמת את השטף של המצע בו זמנית באמצעות חימצון גלוקוז וחמצון חומצות שומן בלב עכברוש עבודה מבודד. המדידות אז יכולות להיות על גבי לפרמטרים הפונקציונליים הלב נרשמו כדי לקבוע את הקשר בין מטבוליזם מצעים ולעבוד לב בתנאי בסיס ומתח (שינוי בעומס ע?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
