Metoder for bestemmelse av priser av glukose og fettsyreoksidasjon i isolerte Working Rat Hjerte

Summary

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Abstract

Pattedyr hjerte er en stor forbruker av ATP og krever en konstant tilførsel av energi substrater for sammentrekning. Ikke overraskende forandringer i myokardial metabolisme har vært knyttet til utviklingen av kontraktile dysfunksjon og hjertesvikt. Derfor rakne koblingen mellom stoffskiftet og sammentrekning skal belyse noen av de mekanismene som styrer hjerte tilpasning eller maladaptation i sykdomstilstander. Det isolerte arbeidsrottehjerte preparat kan anvendes for å følge, samtidig og i sanntid, kardial kontraktil funksjon og forandring av energigivende substrater til oksidative metabolske veier. Denne protokoll som mål å gi en detaljert beskrivelse av metodene som brukes til fremstilling og bruk av buffere for kvantitativ måling av satsene for oksidasjon for glukose og fettsyrer, hovedenergigivende substrater av hjertet. Metodene som benyttes for analyse av prøver og data tolkning blir også diskutert.I korte trekk, er teknikken basert på leveranse av ¹⁴ C- radiomerket glukose og en ^tre H- radiomerket langkjedet fettsyre til en ex vivo bankende hjerte via normotermisk crystalloid perfusjon. ¹⁴ CO ₂ og ³ H ₂ O, ende biprodukter av de enzymatiske reaksjoner som er involvert i bruken av disse energi tilveiebringe substrater, blir deretter kvantitativt gjenvunnet fra den koronare avløpet. Med kjennskap til den spesifikke aktivitet av den radiomerkede substrater som benyttes, er det da mulig å individuelt kvantifisere fluksen av glukose og fettsyre i oksidasjonsreaksjonsveier. Kontraktile funksjon av det isolerte hjertet kan bestemmes i parallell med den aktuelle opptaksutstyr og direkte korrelert til metabolske fluks-verdier. Den teknikken er svært nyttig å undersøke metabolismen / sammentrekning forhold som respons på forskjellige stressbetingelser, for eksempel endringer i forhånds og etter belastning og iskemi, et medikament eller et opplagting faktor, eller som følge av endring i ekspresjonen av et genprodukt.

Introduction

klinisk Relevans

I pattedyr hjerte, er det en sterk positiv sammenheng mellom fluksen av substratene gjennom oksidative metabolske veier, ATP generering og hjertearbeid ^1. I løpet av de siste to tiårene, har etterforskningen av den intrikate sammenhengen mellom hjerte metabolisme og funksjon førte til erkjenne at endringer i hjerte metabolisme er en årsak til kontraktile dysfunksjon og muligens patologiske strukturelle ombygging i innstillingen av ulike typer hjertesykdom ^2-4. derfor er det forventet at vår forståelse av mekanismene som styrer metabolsk ombygging av stresset hjerte vil føre til identifisering av terapeutiske mål for forebyggelse eller behandling av hjertesvikt ^5-7. Den nylige utgivelsen av en vitenskapelig uttalelse fra American Heart Association på "Assessing Cardiac Metabolism" understreker den økende interessen av det vitenskapelige samfunn for thans forskningsfelt ^8. Men mens de teknologiske fremskritt innen hjerteavbildning nå åpner for en rask og nøyaktig vurdering av hjerte morfologi og funksjon, in vivo studier av hjerte stoffskiftet er fortsatt begrenset og tyngende: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi og Positron Emission Tomography (PET) avbildning kan brukes til å følge hjerte høy energi fosfat metabolisme og Krebs syklus aktivitet, men disse teknikkene er plaget av høye driftskostnader og av deres manglende evne til å bestemme bidraget fra ulike underlag til oksidativ metabolisme i steady-state ⁹ .For denne datoen ex vivo hjertet preparat representerer den eneste og unike teknikk tilgjengelig for å studere, samtidig og i sanntid, kontraktile funksjon og fluksen av substrater til oksidative metabolske veier ^7,9. Følgende protokoll tar sikte på å tilveiebringe retningslinjer i fremstilling og bruk av reagenser benyttet for å bestemme den rottees av substrater utnyttelse i den isolerte arbeidsrottehjerte.

Den Isolert Arbeids Rodent Hjerte Apparatus

Selv om teknikken er nesten et halvt århundre gammel, forblir isolert arbeider rottehjerte forberedelse en metode for valg for kardiovaskulær forskning. Som med den Langendorff-hjerte fremstillingen, arbeids gnager hjertet har en forholdsvis enkel, pålitelig og rimelig måte for å måle et bredt spekter av hjerte parametre uavhengig av de ledsagende virkninger av andre organer, neurohormonal og andre sirkulerende faktorer. Men i motsetning til Langendorff-hjerte perfusert, fortsetter arbeids hjerte å utføre nesten fysiologisk hjertearbeid, er en forutsetning for generering av oksydativ metabolsk flux til nivåer som er relevante for in vivo-betingelser. Dette oppnås ved å levere perfusjon buffer til den venstre ventrikkel (LV) via en kanyle koblet til det venstre atrium, og som LV fylles og trekker seg sammen, ibuffer utstøtes gjennom aorta linje mot en bestemt afterload hydrostatisk trykk. Utformingen av perfusjon apparatet opprinnelig beskrevet av Neely og kolleger ¹⁰ ble senere forbedret ved Taegtmeyer, Hems og Krebs ^11, men har endret seg lite siden den gang. Som beskrevet i den opprinnelige anordningen kan kontraktile funksjon vurderes ved bestemmelse av hjertets minuttvolum, ved hjelp av ikke mer enn graderte sylindere og en stoppeklokke for å måle aorta og koronar flyter ^10,11. Flere leverandører tilbyr nå komplett arbeids gnager hjertet perfusjon systemer. Disse kommersielt tilgjengelig apparat kan bli kjøpt med flowprobes, press transdusere, en trykk volum kateter og alt nødvendig utstyr for hjerte funksjonell datainnsamling og analyse. Leverandørene gir omfattende dokumentasjon og treninger for å lest den nye brukeren med sitt utstyr. Flere oversiktsartikler også detalj protokoller på arbeids hjertet Instrumentering og ved bruk av kateter for å måle hjertefunksjonen hos gnagere ^12-15. Av denne grunn, vil vi bare kort nevne oppsett av perfusjon anordningen og registreringsutstyret. Denne protokoll heller tar sikte på å utfylle den allerede tilgjengelig informasjon med en beskrivelse av de metoder som kan iverksettes for å samtidig måle utbredelsen av glukose og langkjedet fettsyre oksidasjon, de to store energi gi underlag i normal hjerte. Vi beskriver her alle trinnene som er involvert i bruk av radiomerkede energi underlag for vurdering av hjerteinfarkt oksidativ metabolisme, fra utarbeidelse av reagenser og buffere til gjenvinning og behandling av prøver, til dataanalyse.

Prinsipper for Method

Cardiomyocytes generere mesteparten av sin energi til sammentrekning fra oksidativ fosforylering av fettsyrer (hovedsakelig langkjedede fettsyrer) og karbohydrater (glucose og laktat). Hjertet har svært begrenset energisk reserver og er avhengig av en kontinuerlig tilførsel av disse energi tilveiebringe substrater fra sirkulasjonen. Nedbrytningen av glukose inn i glykolysen gir pyruvat som deretter dekarboksyleres av pyruvat-dehydrogenase-komplekset av den indre mitokondrie-membran. Langkjedede fettsyrer, hentet fra sirkulerende albumin eller lipoprotein triglyserider, blir først aktivert i acyl-CoA-molekyler i cytosol og senere transportert inn i mitokondrie matrise gjennom karnitin shuttle å gå inn i beta-oksidasjon veien. Den acetyl-CoA-molekyler som produseres ved nedbrytningen av glukose og fettsyrer drivstoff Krebs syklus for å generere de reduserende ekvivalenter (NADH og fadh ₂₎ som benyttes ved elektrontransportkjeden for å bygge det proton-drivkraft på tvers av den indre mitokondrie-membran og generere ATP gjennom aktiviteten av ATP-syntase. Vann og karbondioksyd er biprodukter av endede enzymatiske reaksjoner som finner sted inne i Krebs syklus. Tilgangen på ¹⁴ C og ³ H- radiomerkede substrater (for eksempel ¹⁴ C-radioaktivt merket glukose og ^{3H-radiomerket} oljesyre) til det isolerte hjertet arbeider vil følgelig føre til produksjon av ¹⁴ CO ₂ og ³ H ₂ O som mulig kvantitativt gjenvunnet fra den koronare avløpet. Samlingen av ¹⁴ CO ₂ utføres ved å holde det isolert perfusert hjerte inn i et lukket kammer, og ved straks å utvinne den koronare effluenten som kommer ut av hjertet. En liten anionbytterkolonne brukes til å separere og utvinne ³ H ₂ O fra den koronare avløpet. Radioaktiviteten av de behandlede prøvene blir målt med en væskescintillasjonsteller, og med kjennskap til den spesifikke aktivitet av den radiomerkede substrater anvendes, er det da mulig å individuelt kvantifisere fluksen av glukose og fettsyre ioksidasjon trasé ^16,17.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til NIH Public Health Service politikk på Human Care og bruk av dyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Mississippi Medical Center. Alle prosedyrer som involverer bruk av radioisotoper ble godkjent og utført i henhold til retningslinjer fastsatt av stråling sikkerhet kontoret ved University of Mississippi Medical Center. 1. Utarbeidelse av arkiv Buffer Solutions og reagenser Krebs-Hensel…

Representative Results

To representative eksperimenter er beskrevet i tallene nedenfor. I begge tilfeller ble hjertet av en 16 uker gamle Sprague Dawley rotter og isolert perfusert i arbeidsmodus med KH buffer fremstilt i henhold til den foregående protokollen. I hvert forsøk ble hjerte underkastet en spenningstilstand for å påvirke hjertearbeid. Cardiac kontraktile funksjon ble målt ved kontinuerlig registrering av pulstrykket ved innføring av en trykkgiver i aorta linje og ved bestemmelse av hjertekraf…

Discussion

Den foregående protokollen detaljer metoder for samtidig å kvantifisere fluksen av substratet gjennom glukoseoksidasjon og fettsyre oksidasjon i det isolerte arbeidende rottehjerte. Målingene kan da bli overlagret på de registrerte hjerte funksjonelle parametre for å bestemme forholdet mellom substratene metabolisme og hjerte- arbeid under basislinje og spenningsforholdene (endring i arbeidsbelastning, ischemi-reperfusjon, etc …). Det er også mulig å evaluere hvor metabolismen / sammentrekning forhold …

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)	Fisher Scientific	M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific	S233
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g	Bio-Rad	1401441	This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g	Bio-Rad	1432445	Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder	Fisher Scientific	09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318	Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder	Fisher Scientific	11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	EMD Millipore	820027	We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate	Sigma-Aldrich	O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-	PerkinElmer	NET289005MC	Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter	Fisher Scientific	08-667E
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glucose, D-[14C(U)]-	PerkinElmer	NEC042B005MC	Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100	Eli Lilly and Company	NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate	Sigma-Aldrich	T133	Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid	Roboz Surgical	SUT-15-3
10X Hyamine Hydroxide	PerkinElmer	6003005	Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 mL Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-341-25E	Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 mL HDPE Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-337-23B	Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers	Fisher Scientific	14-126DD	Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm	BD	305194	Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60%	Fisher Scientific	A228	Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail	PerkinElmer	6013327
Glass Wool	Fisher Scientific	AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder	Fisher Scientific	04-355	For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent	Fisher Scientific	16-000-115	For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue