Методы определения ставок глюкозы и жирных кислот Окисление в изолированной рабочей сердца крысы
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Сердце млекопитающих является основным потребителем АТФ и требует постоянного притока энергетических субстратов для сокращения. Не удивительно, что изменения метаболизма миокарда, были связаны с развитием сократительной дисфункции и сердечной недостаточности. Таким образом, распутывая связь между обменом веществ и сокращения должны пролить свет на некоторые из механизмов, регулирующих сердца адаптации или дезадаптации в болезненных состояниях. Выделенную подготовки рабочей сердце крысы может быть использован, чтобы следовать, одновременно и в реальном времени, сердечной сократительной функции и потока энергии, обеспечивающей субстратов в окислительных метаболических путей. Настоящий Протокол призван обеспечить детальное описание методов, используемых при подготовке и использовании буферов для количественного измерения скоростей окисления для глюкозы и жирных кислот, основной энергии, обеспечивающей субстраты сердца. Обсуждаются также методы, используемые для анализа проб и интерпретации данных.Короче говоря, этот метод основан на поставку 14 C- меченного глюкозы и 3 Н- меченного с длинной цепью жирной кислоты в естественных условиях ех бьющееся сердце через нормотермической кристаллоидным перфузией. 14 CO 2 и 3 H 2 O, концевые субпродукты ферментативные реакции, участвующие в использовании этих энергетических субстратов при условии, затем количественно извлекают из коронарного сточных вод. Со знанием специфической активности радиоактивно меченных субстратов, используемых, то тогда можно индивидуально количественно оценить поток глюкозы и жирных кислот в пути окисления. Сократительной функции изолированного сердца может быть определено параллельно с соответствующим оборудованием для записи и непосредственно коррелирует с метаболическими значений потока. Методика является чрезвычайно полезным для изучения взаимосвязи метаболизма / сокращения в ответ на различные стрессовых условиях, таких как изменения в до и после нагрузки и ишемии, препарат или циркуляциейтин фактор, или после изменения в экспрессии продукта гена.
Introduction
Клиническая значимость
В сердце млекопитающих, существует сильная положительная связь между потоком субстратов через окислительных метаболических путей, АТФ поколения и работы сердца 1. За последние два десятилетия исследование сложной взаимосвязи между заболеванием сердца метаболизма и функции привело признать , что изменения в сердечной метаболизма являются причиной для сократительной дисфункции и , возможно , патологической структурной перестройки в установке различных типов заболеваний сердца 2-4. Таким образом, ожидается , что наше понимание механизмов , регулирующих метаболические ремоделирование напряженном сердца приведет к идентификации терапевтических мишеней для профилактики или лечения сердечной недостаточности 5-7. Недавняя публикация научного высказывания из Американской кардиологической ассоциации на тему «Оценка сердечного метаболизма» подчеркивает растущий интерес научного сообщества для тего область исследований 8. Но в то время как технологические достижения в области визуализации сердца в настоящее время позволяют для быстрой и точной оценки сердечной морфологии и функции, исследование в естественных условиях сердечного метаболизма остается ограниченным и обременительным: ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии и позитронно – эмиссионной томографии (ПЭТ) может можно использовать , чтобы следовать сердца высокой энергии фосфатный метаболизм и активность цикла Кребса, но эти методы страдают от высоких операционных затрат и их неспособностью определить вклад различных субстратов для окислительного метаболизма в стационарных условиях 9 .to эту дату экс естественных условиях рабочая подготовка сердца представляет единственный и уникальный метод доступен для изучения, одновременно и в реальном масштабе времени, сократительной функции и потока субстратов в окислительных метаболических путей 7,9. Следующий протокол направлен на обеспечение руководящих принципов в подготовке и использовании реагентов, используемых для определения крысуэс утилизации субстратов изолированного сердца крысы. Рабочая
Изолированные Аппарат сердца Рабочая Грызун
Несмотря на то, что техника почти полвека назад, изолированная рабочая подготовка крысы сердце остается методом выбора для сердечно-сосудистых исследований. Как и при подготовке Лангендорфа сердца, рабочее грызун сердце предлагает сравнительно простой, надежный и недорогой способ измерить широкий диапазон параметров сердца независимо от искажающих эффектов других органов, нейрогуморальных и других циркулирующих факторов. Но в отличие от Langendorff-перфузируемом сердце, рабочее сердце продолжает выполнять почти физиологическую работу сердца, что является необходимым условием для формирования окислительного метаболического потока до уровней , которые имеют отношение к условиям в естественных условиях. Это достигается за счет предоставления буфера перфузионного в левый желудочек (ЛЖ) через канюлю, соединенного с левым предсердием, а также Л.В. заполняет и контракты, тоБуфер выбрасывается через аортальный линии против определенного постнагрузки гидростатического давления. Конструкция аппарата перфузионного первоначально описанной Neely и коллегами 10 была впоследствии улучшена Taegtmeyer, рубчики и Кребса 11, но очень мало изменилось с тех пор. Как описано в исходном устройстве, сократительная функция может быть оценена путем определения сердечного выброса, используя не более , чем градуированные цилиндры и секундомер для измерения аортального и коронарного потоки 10,11. Некоторые производители в настоящее время предлагают полный рабочий грызуна системы сердца перфузионных. Эти коммерчески доступные аппараты могут быть приобретены с flowprobes, датчиками давления, давление объема катетера и все оборудование, необходимое для остановки функционального сбора и анализа данных. Производители предоставляют обширную документацию и учебные сессии для ознакомления нового пользователя с их оборудованием. Несколько обзорных статей также подробно протоколы о работающем сердце INSTRUMентация и об использовании катетеров для измерения сердечной функции у грызунов 12-15. По этой причине, мы лишь кратко упомянуть настройку аппарата перфузионного и записывающего оборудования. Настоящий протокол скорее нацелен дополнить уже имеющуюся информацию с описанием методов, которые могут быть реализованы для одновременного измерения скорости глюкозы и окисления длинноцепочечных жирных кислот, два основных энергетических субстратов в обеспечении нормального сердца. Здесь мы опишем все шаги, связанные с использованием меченных энергетических субстратов для оценки окислительного метаболизма миокарда, от подготовки реагентов и буферов для восстановления и обработки образцов, для анализа данных.
Основы метода
Кардиомиоциты генерируют большую часть своей энергии для сжатия из-за окислительного фосфорилирования жирных кислот (главным образом, длинноцепочечные жирные кислоты) и углеводы (glucosе и лактата). Сердце имеет очень ограниченный энергетические запасы и опирается на постоянное снабжение этих энергетических субстратов из обеспечения циркуляции. Катаболизм глюкозы через гликолиза приводит к пирувата, который затем декарбоксилируют пируватдегидрогеназного комплекса внутренней митохондриальной мембраны. Длинноцепочечные жирные кислоты, извлекаемые из циркулирующих альбумин или липопротеинов триглицериды, которые сначала активируют в молекулы ацил-КоА-редуктазы в цитозоле, а затем транспортируется в митохондриях через челнок карнитина, чтобы войти в пути бета-окисления. В ацетил-СоА – молекул , продуцируемых катаболизма глюкозы и жирных кислот топлива цикл Кребса для генерации восстанавливающих эквивалентов (NADH и FADH 2) , которые используются в цепи переноса электронов для создания протон-движущей силы поперек внутренней митохондриальной мембраны и генерации АТФ через активность АТФ-синтазы. Вода и углекислый газ являются конечными субпродуктовферментативные реакции, происходящие внутри цикла Кребса. Подачу 14 С- и 3 Н- радиоактивно меченных субстратов (например, 14 С-меченного глюкозы и 3 Н-меченного олеиновой кислоты) к изолированному рабочего сердца будет , следовательно , приводить к получению 14 CO 2 и 3 H 2 O , который может количественно извлекают из коронарного вытекающего потока. Сбор 14 CO 2 осуществляют путем поддержания изолированных перфузии сердца в герметичную камеру и сразу же восстановление коронарного потока , выходящего при его выходе из сердца. Небольшая колонна анионообменной используется для разделения и восстановления 3 H 2 O из коронарного стоках. Радиоактивность из обработанных образцов измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, и со знанием специфической активности радиоактивно меченных субстратов, используемых, то тогда можно индивидуально количественно оценить поток глюкозы и жирных кислот вокисления дорожками 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предшествующий протокол подробно методы для одновременного количественного определения потока субстрата через Окисление глюкозы и окисление жирных кислот в изолированном сердце крысы рабочего. Измерения могут быть наложены к записанным сердца функциональных параметров для опреде…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
