Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.
Introduction
Relevancia clínica
En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación metabólica del corazón subrayado dará lugar a la identificación de dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de la insuficiencia cardíaca 5-7. La reciente publicación de una declaración científica de la American Heart Association sobre "Evaluación de metabolismo cardíaco", subraya el creciente interés de la comunidad científica para tsu campo de investigación 8. Sin embargo, aunque los avances tecnológicos en imagen cardiaca ahora permiten una evaluación rápida y precisa de la morfología y la función cardíaca, el estudio in vivo del metabolismo cardiaco sigue siendo limitado y onerosa: la espectroscopia y resonancia magnética nuclear (RMN) Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) puede se utiliza para seguir el metabolismo del fosfato de alta energía cardiaca y la actividad del ciclo de Krebs, pero estas técnicas se ven afectadas por los altos costos de operación y por su incapacidad para determinar la contribución de diversos sustratos para el metabolismo oxidativo en condiciones de estado estacionario 9 .Para esta fecha, el ex vivo trabajando preparación de corazón representa la sola y única técnica disponible para estudiar, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil y el flujo de sustratos metabólicos oxidativos en las vías de 7,9. El siguiente protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices para la preparación y utilización de los reactivos utilizados para determinar la rataes la utilización de sustratos en el corazón de rata aislado de trabajo.
El aparato aislado del corazón de roedores de Trabajo
Aunque la técnica es casi la mitad de un siglo de antigüedad, la preparación aislada de corazón de rata de trabajo sigue siendo un método de elección para la investigación cardiovascular. Al igual que con la preparación de corazón Langendorff, el corazón de roedores de trabajo ofrece una manera relativamente simple, fiable y de bajo costo para medir una amplia gama de parámetros cardíacos independientemente de los efectos de confusión de otros órganos, y otros factores neurohormonales circulantes. Pero en contraste con el corazón perfundido Langendorff, el corazón trabaja sigue llevando a cabo el trabajo cardíaco cercanas a las fisiológicas, un requisito previo para la generación de flujo metabólico oxidativo a niveles que son relevantes a las condiciones in vivo. Esto se logra mediante la entrega de la memoria intermedia de perfusión en el ventrículo izquierdo (VI) a través de una cánula conectada a la aurícula izquierda, y como el LV se llena y se contrae, latampón es expulsado a través de la línea aórtica frente a una presión hidrostática de la poscarga determinado. El diseño del aparato de perfusión descrito originalmente por Neely et al 10 fue mejorado posteriormente por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, pero ha cambiado muy poco desde entonces. Como se describe en el aparato original, la función contráctil se puede evaluar mediante la determinación del gasto cardíaco, utilizando no más de probetas graduadas y un cronómetro para medir los flujos aórtico y coronario 10,11. Varios vendedores ofrecen ahora sistemas completos de roedores de trabajo de perfusión del corazón. Estos aparatos disponibles en el mercado se puede adquirir con flowprobes, transductores de presión, un catéter de presión-volumen y todo el equipo necesario para la adquisición de datos de la función cardíaca y el análisis. Los proveedores ofrecen extensas sesiones de documentación y formación para familiarizar a los nuevos usuarios con sus equipos. Varios artículos de revisión también protocolos de detalle en el corazón trabaja instrumentación y en el uso de catéteres para medir la función cardiaca en los roedores 12-15. Por esta razón, sólo mencionaremos brevemente la configuración del aparato de perfusión y el aparato de control. El presente protocolo y no tiene por objeto complementar la información ya disponible con una descripción de los métodos que se pueden implementar para medir simultáneamente las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, los dos principales sustratos energéticos que proporciona en el corazón normal. Describimos aquí todos los pasos implicados en el uso de sustratos de energía radiomarcados para la evaluación del metabolismo oxidativo del miocardio, de la preparación de los reactivos y tampones a la recuperación y procesamiento de las muestras, al análisis de datos.
Principios del método
Cardiomiocitos generan la mayor parte de su energía para la contracción de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos (ácidos grasos de cadena larga principalmente) y carbohidratos (Glucose y lactato). El corazón se ha muy limitada reservas energéticas y depende de un suministro constante de estos sustratos de energía que proporciona a partir de la circulación. El catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica produce piruvato que después se descarboxila por el complejo piruvato deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna. ácidos grasos de cadena larga, extraídos de circulación de albúmina o lipoproteína de triglicéridos, se activan primero en moléculas de acil-CoA en el citosol y posteriormente transportados dentro de la matriz mitocondrial a través de la lanzadera de la carnitina para entrar en la vía de oxidación beta. Las moléculas de acetil-CoA producidos por el catabolismo de la glucosa y los ácidos grasos combustible el ciclo de Krebs para generar los equivalentes reductores (NADH y FADH 2) que son utilizados por la cadena de transporte de electrones para construir la fuerza protón-motriz través de la membrana mitocondrial interna y generar ATP a través de la actividad de la ATP sintasa. Agua y dióxido de carbono son los subproductos de extremo delas reacciones enzimáticas que tienen lugar dentro del ciclo de Krebs. El suministro de 14 C y 3 H- sustratos radiomarcados (como 14 C-glucosa radiomarcada y ácido oleico 3 H-radiomarcado) para el corazón aislado de trabajo será por consiguiente dar lugar a la producción de 14 CO 2 y 3 H 2 O que puede recuperar cuantitativamente a partir del efluente coronario. La colección de 14 CO 2 se lleva a cabo manteniendo el corazón aislado y perfundido en una cámara sellada y por la recuperación inmediatamente el efluente coronario a medida que sale del corazón. Una columna pequeña de intercambio aniónico se usa para separar y recuperar 3 H 2 O del efluente coronario. La radiactividad de las muestras procesadas se mide con un contador de centelleo líquido, y con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados utilizado, entonces es posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácido graso en lala oxidación vías 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc …). También es pos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
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