Metoder för bestämning av priser av glukos och fettsyra oxidation i isolerade Working Rat hjärta
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Däggdjurs hjärta är en stor konsument av ATP och kräver en ständig tillförsel av energisubstrat för kontraktion. Inte överraskande, har förändringar av myocardial metabolism varit kopplade till utvecklingen av kontraktila dysfunktion och hjärtsvikt. Därför bör reda ut sambandet mellan metabolism och kontraktion belysa några av de mekanismer som styr hjärt anpassning eller missanpassning i sjukdomstillstånd. Den isolerade arbetsråtthjärta preparatet kan användas för att följa, samtidigt och i realtid, hjärtsammandragningsfunktion och flöde av energi som ger underlag till oxidativa metaboliska vägar. Det nuvarande protokollet syftar till att ge en detaljerad beskrivning av de metoder som används vid framställningen och användningen av buffertar för kvantitativ mätning av andelen oxidation för glukos och fettsyror, huvudenergigivande substrat i hjärtat. De metoder som används för provanalys och tolkning av data är också diskuteras.I korthet, är tekniken baserad på leverans av 14 C- radiomärkt glukos och en 3 H- radiomärkt långkedjig fettsyra till en ex vivo bultande hjärta via normotermisk kristalloid perfusion. 14 CO 2 och 3 H2O, slut biprodukter av enzymatiska reaktioner är involverade i användningen av dessa energi ger substrat, därefter kvantitativt återhämtat sig från krans utflödet. Med kännedom om den specifika aktiviteten hos de radiomärkta substrat som används, är det sedan möjligt att individuellt kvantifiera flödet av glukos och fettsyra i de oxidationstillstånd vägar. Kontraktila funktion av det isolerade hjärtat kan bestämmas parallellt med den lämpliga färdskrivaren och direkt korrelerad till metaboliska flödesvärden. Tekniken är mycket användbart för att studera metabolismen / kontraktion förhållande som svar på olika stressförhållanden, såsom förändringar i pre och efter belastning och ischemi, ett läkemedel eller en cirkulationsting faktor, eller efter förändringen i expressionen av en genprodukt.
Introduction
klinisk relevans
I däggdjurs hjärta, det finns en stark positiv relation mellan flödet av substrat genom oxidativa metaboliska vägar, ATP generation och hjärtarbetet en. Under de senaste två decennierna har utredningen av intrikata sambandet mellan hjärt metabolism och funktion har lett till att inse att förändringar i hjärtmetabolism är en orsak till kontraktil dysfunktion och eventuellt patologiska strukturell ombyggnad i fastställandet av olika typer av hjärtsjukdomar 2-4. därför förväntas det att vår förståelse av de mekanismer som styr metaboliska ombyggnad av den stressade hjärta kommer att leda till identifiering av terapeutiska mål för förebyggande eller behandling av hjärtsvikt 5-7. Den senaste offentliggörandet av en vetenskaplig förklaring från American Heart Association "bedöma Cardiac Metabolism", betonar det växande intresset för det vetenskapliga samfundet för thans forskningsområde 8. Men medan de tekniska framstegen inom hjärtavbildning tillåter nu för en snabb och noggrann utvärdering av hjärt morfologi och funktion, är fortfarande begränsad och betungande studier av hjärtmetabolism in vivo: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi och Positron Emission Tomography (PET) avbildning kan användas för att följa hjärtats högenergifosfat ämnesomsättning och Krebs cykel aktivitet, men dessa tekniker plågas av höga driftskostnader och deras oförmåga att bestämma bidraget av olika substrat till oxidativ metabolism i steady state 9 .För detta datum ex vivo arbets hjärta förberedelse representerar den enda och unika teknik som finns tillgänglig för att studera, samtidigt och i realtid, kontraktila funktion och flöde av substrat i oxidativa metaboliska vägar 7,9. Följande protokoll syftar till att ge riktlinjer vid framställning och användning av reagens som används för att bestämma råttaes av substrat utnyttjande i isolerade arbets råtta hjärta.
De isolerade Working Gnagare hjärta Apparatus
Även om tekniken är nästan ett halvt sekel gamla, isolerade arbetsråtthjärta förberedelse fortfarande en metod för val för kardiovaskulär forskning. Som med Langendorff hjärt beredning, erbjuder arbets gnagare hjärtat en relativt enkel, tillförlitlig, och billigt sätt att mäta ett brett spektrum av hjärtparametrar oberoende av de störande effekterna av andra organ, neurohormonella och andra cirkulerande faktorer. Men i motsats till Langendorff-perfusion hjärta, fortsätter att arbeta hjärtat att utföra nästan fysiologiska hjärtarbetet, en förutsättning för generering av oxidativa metabola flux till nivåer som är relevanta för in vivo-betingelser. Detta uppnås genom att leverera perfusionsbuffert till den vänstra kammaren (LV) via en kanyl som är ansluten till det vänstra förmaket, och såsom LV fyller och kontrakt,buffert matas ut genom aorta linje mot en bestämd afterload hydrostatiskt tryck. Utformningen av perfusion apparaten ursprungligen beskrevs av Neely och kollegor 10 därefter förbättrades med Taegtmeyer, Hems och Krebs 11, men har förändrats mycket lite sedan dess. Som beskrivits i den ursprungliga apparaten kan kontraktila funktion bedömas genom bestämning av hjärtminutvolym med hjälp av högst mätglas och ett stoppur för att mäta aorta och koronarflöden 10,11. Flera leverantörer erbjuder nu kompletta arbets gnagare hjärta perfusion system. Dessa kommersiellt tillgänglig apparat kan förvärvas med flowprobes, tryckgivare, en tryck volym kateter och all utrustning som behövs för hjärt funktionell datainsamling och analys. De leverantörer ger omfattande dokumentation och utbildning för att bekanta den nya användaren med sin utrustning. Flera översiktsartiklar också detaljprotokoll på arbets hjärta instrumsenta och om användningen av katetrar för att mäta hjärtfunktionen hos gnagare 12-15. Av denna anledning kommer vi endast kortfattat nämna installation av perfusion apparater och färdskrivaren. Det nuvarande protokollet syftar snarare att komplettera redan tillgänglig information med en beskrivning av de metoder som kan genomföras för att samtidigt mäta andelen glukos och långkedjiga fettsyra oxidation, de två stora energi ger substrat i normalt hjärta. Vi beskriver här alla de steg som ingår i användningen av radiomärkta energisubstrat för bedömning av myokardial oxidativ metabolism, från framställningen av reagens och buffertar till återvinning och bearbetning av prover, till dataanalysen.
Principer för metoden
Kardiomyocyter generera huvuddelen av sin energi för sammandragning från den oxidativa fosforyleringen av fettsyror (huvudsakligen långkedjiga fettsyror) och kolhydrater (glucose och laktat). Hjärtat har mycket begränsad energiska reserver och förlitar sig på en konstant tillförsel av dessa energikällor ger substrat från cirkulationen. Katabolismen av glukos genom den glykolytiska vägen ger pyruvat som sedan dekarboxyleras av pyruvatdehydrogenaskomplexet av det inre mitokondriemembranet. Långkedjiga fettsyror, extraherade från cirkulerande albumin eller lipoprotein triglycerider, först aktiveras till acyl-CoA-molekyler i cytosolen och därefter transporteras inne i mitokondriematrisen genom karnitin shuttle att gå in i beta-oxidation pathway. Acetyl-CoA molekyler som produceras av katabolismen av glukos och fettsyror bränsle Krebs cykel för att generera de reducerande ekvivalenter (NADH och FADH2) som används av elektrontransportkedjan att bygga den proton-drivkraft över det inre mitokondriemembranet och generera ATP genom aktiviteten av ATP-syntas. Vatten och koldioxid är slut biprodukter avenzymatiska reaktioner som sker inne i Krebs cykel. Leverans av 14 C- och 3 H- radiomärkta substrat (såsom 14 C-radiomärkt glukos och 3 H-radiomärkt oljesyra) till den isolerade arbets hjärta kommer följaktligen att leda till produktion av 14 CO2 och 3 H 2 O som kan kvantitativt utvinnas från krans utflödet. Insamlingen av 14 CO 2 utförs genom att hålla isolerad perfusion hjärtat i en förseglad kammare och genom att omedelbart återhämta sig krans utflödet när det lämnar hjärtat. En liten anjonbytarkolonn användes för att separera och utvinna 3 H2O från krans utflödet. Radioaktiviteten från de bearbetade proverna mäts med en vätskescintillationsräknare, och med kännedom om den specifika aktiviteten hos de radiomärkta substrat används, är det då möjligt att individuellt kvantifiera flödet av glukos och fettsyra i denoxidation vägar 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Föregående protokoll beskrivs de metoder för att samtidigt mäta flödet av substrat genom glukos oxidation och fettsyra oxidation i isolerade arbetsråtthjärta. Mätningarna kan sedan överlagras till de registrerade hjärt funktionella parametrar för att bestämma förhållandet mellan substrat metabolism och hjärtats arbete enligt baslinjen och stressförhållanden (förändring i arbetsbelastning, ischemi-reperfusion, etc …). Det är också möjligt att utvärdera hur metabolismen / kontraktion för…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochimie. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
