استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
نمو الجذعية الثانوي في الأشجار وتشكيل الخشب المرتبطة هم كبير سواء من وجهة نظر بيولوجية والتجارية. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل نسبيا عن السيطرة الجزيئية التي تتحكم تنميتها. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى المادية، والموارد وضيق الوقت وغالبا ما ترتبط مع دراسة عمليات النمو الثانوية. وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر تنطوي إما مصنع جزء أو نظام مصنع كامل في كلا الخشبية والنباتات غير الخشبية. ومع ذلك، تساؤلات حول إمكانية تطبيقها لدراسة عمليات النمو الجذعية الثانوية، وعناد بعض الأنواع وكثافة اليد العاملة وغالبا ما تكون باهظة للأجل المتوسط إلى تطبيقات إنتاجية عالية. أيضا، عند النظر في تطوير الجذعية والخشب تشكيل الثانوي سمات محددة في إطار التحقيق قد تصبح فقط قابلة للقياس في وقت متأخر من دورة حياة الشجرة بعد عدة سنوات من النمو. في التصدي لهذه التحديات بديل في الجسم الحي صوقد وضعت rotocols، واسمه المستحثة الجسدية تحليل القطاع، والتي تنطوي على إنشاء قطاعات الأنسجة الجسمية المعدلة وراثيا مباشرة في الجذعية الثانوية للنبات. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة فعالة وسهلة وسريعة نسبيا لخلق الأنسجة النباتية الثانوية المعدلة وراثيا لالجيني وتوصيف وظيفي المروج التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من أنواع الأشجار. وتشير النتائج المعروضة هنا أن القطاعات الجذعية الثانوية المعدلة وراثيا يمكن أن تنشأ في جميع الأنسجة الحية وأنواع الخلايا في ثانويه ينبع من مجموعة متنوعة من أنواع الأشجار والخشب الصفات المورفولوجية وكذلك أنماط التعبير المروج في الثانوية ينبع يمكن تقييمها بسهولة تسهيل متوسطة إلى عالية توصيف وظيفي الخرج.
Introduction
شجرة ينبع تضم كمية كبيرة من الكتلة الحيوية الكواكب وذات الأهمية البيولوجية والثقافية والتجارية الهائلة. ثانويه ينبع خلق الموائل من خلال توفير الموارد والمأوى للعديد من أشكال الحياة الأخرى. أنها تقدم العديد من الخدمات الأخرى إلى النظم البيئية التي تعيش وتعمل كمورد المتجددة لإنتاج الأخشاب والورق وغيرها من الخشب والمنتجات غير الخشبية. ويخضع تنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب بشكل أكثر تحديدا من قبل نظام الجزيئية المعقدة التي تنظم تطوير أنواع معينة من الخلايا، وتكوين كيميائي حيوي من جدران الخلايا وكيفية ترتيبها لتشكل الأنسجة والأعضاء. تشريح الأساس الجزيئي للتنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب ومرتبك من قبل العديد من العوامل بما في ذلك التغير في خصائص الخشب وساق داخل وبين ينبع وأوقات الجيل طويلة، ونظم التزاوج خارج المعبر، وارتفاع تغاير، وتحميل وراثية عالية، السكون الموسمية، طويل ناضجفترات إقامة السمات الشخصية والحجم المادي الهائل من الأشجار الناضجة. ونتيجة لذلك، فهم التنمية الجذعية الثانوية بالنسبة إلى معرفة تفصيلية لمعظم جوانب أخرى من السيطرة الجزيئية لتطوير المصنع، لا تزال في مهدها.
وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر لدراسة وفهم تطور الجذعية الثانوية، في الخشب معين والثانوي تشكيل جدار الخلية. وتشمل هذه البروتوكولات استخدام نبات كامل أو أنظمة جزء النبات، حيث يتم إنشاء أي النباتات المعدلة وراثيا أو يتم تحويل خلايا الثانوية محددة أو أنسجة لدراسة جوانب معينة من الخشب و / أو تطوير الجذعية الثانوي 1. النباتات المعدلة وراثيا يمكن استرداد تحول آخر الوراثي من مجموعة واسعة من الأنسجة النباتية وأنواع الخلايا، ولكن التقدم بطيء، ولا سيما عند تحليل سمات ألياف الخشب بسبب تجديد الطويل ووقف الأوقات النضج (بالترتيب من سنة)، عالية التقنية و رواجا العملس، والإنتاجية المنخفضة من الجينات المرشحة وكذلك صعوبات في نشر بعض أنواع النباتات الخشبية. وقد تم تطوير تقنيات مماثلة في نظام نموذجي غير الخشبية مثل نبات الأرابيدوبسيس أن التغلب بنجاح بعض من هذه القيود، ولكن ليس كل أنواع الخلايا الجذعية الثانوية حاضر في هذه السيقان والصفات المتعلقة موسمية أو طول العمر لا يمكن أن تدرس في مثل هذه الأنواع 2. بدلا من ذلك، نظم جزء النبات، مثل Pinu الصورة رديتا الثقافات الكالس 3 تقلل من الأطر الزمنية المرتبطة بها. هذه الأساليب ولكن تقتصر على الدراسة وجود نوع من الخلايا الفردية ويعاني قيودا مماثلة كما لوحظ للتجارب في المختبر. وبالمثل، فقد أظهرت الثقافات الجذعية قمي 4 تنطوي إإكسبلنتس الجذعية كلها الوعد ولكن حتى الآن لم يتم تطبيق لدراسة الجينات أو المروجين لمصلحة محددة. وفي الآونة الأخيرة، تم وضع بروتوكول بديل تنطوي على الثقافات جذور شعر ليوكاليبتوس وكان بنجاحتطبيق 5، ولكن هذا الأسلوب لا يزال يتطلب في زراعة المختبر، ينطوي على الجذور الثانوية بدلا من السيقان وحتى الآن يقتصر على أنواع الأشجار واحدة.
الناجم عن تحليل قطاع الجسدية (ISSA)، كما هو موضح هنا، وقد وضعت للتغلب على بعض هذه المشاكل توفير متوسطة الى عالية الإنتاجية أداة فحص وظيفي للجينات والمروجين مع الأدوار يشتبه في تشكيل الخشب وتنمية أنسجة الساق الثانوية. ISSA هو التحول وفحص نظام في الجسم الحي والتي وضعت للحد من الوقت اللازم لإنتاج خلايا معدلة وراثيا والأنسجة في جذع الثانوي سليمة في حين التغلب العمل، والقيود الفنية والإنتاجية من روتيني المستخدمة في أساليب المختبر. البروتوكولات وصفها هنا تسمح لإنشاء وقت واحد من مئات من قطاعات الأنسجة تتحول بشكل مستقل والخلايا في ينبع الثانوية في غضون فترة قصيرة من الزمن، في أنواع الأشجار والأنسجة من الاهتمام دون زتباين enetic و / أو البيئة ضمن أطر زمنية قصيرة نسبيا وانخفاض تكلفة اليد العاملة. وصفت ISSA في الجسم الحي تقنيات أولا لالجذعية الثانوي 6 و برعم 7 الأنسجة ومنذ ذلك الحين تم صقلها في أنسجة الساق الثانوية من خلال دراسات الجينات و / أو المروجين تشارك في التمايز متعلق بالصرف المالي وتشمل: تويولين (الحوض) 8، مثل fasciclin arabinogalactan ( FLA) 9، السليلوز سينسيز (CESA) 10 والثانوي الخلية المرتبطة جدار المجال بريدا (SND2) 11، ARBORKNOX (ARK1) 12 ومثيرة للاهتمام حقا الجين الجديد (RING) H2 البروتين 13. هذه الدراسات أجريت في الثانوية ينبع من النباتات أشجار الحور والكافور، وقدمت نظرة ثاقبة مورفولوجيا الخلايا والكيمياء جدار الخلية والتعبير الجيني.
والغرض من هذه البروتوكولات المذكورة هنا من اجل تقريب وتجربةالثانية المعرفة المكتسبة من خلال تطوير وتطبيق ISSA من مجموعة من الدراسات المنشورة وغير المنشورة على مدى العقد الماضي. وهي تركز على التحول في الجسم الحي من أنسجة الساق الثانوية 6 والتركيز على الدراسات التي تنطوي على استنساخ حور أبيض "الهرمي"، الأوكالبتوس كرية وكذلك 11 الأوكالبتوس كرية س استنساخ البان. تأخذ هذه الوثيقة الباحثون من خلال البروتوكول من زراعة النباتات والبكتيريا، والتحول من أنسجة الساق والنمو والحصاد من الأنسجة، وتحديد الخلايا والأنسجة المعدلة وراثيا، والإعداد لعمليات التقييم وأساليب المظهرية لجمع وتحليل البيانات. في حين تم بنجاح تطبيق تقنيات لقياس جدار الخلية تكوين أحادي السكاريد أيضا 9،11، نظرا لضيق المكان، وتركز هذه الوثيقة على التقنيات المستخدمة لقياس الخلايا والتشكل الأنسجة وفهم أنماط التعبير الجيني في الحادي والثانوينظم الإدارة البيئية فقط. وفقا لذلك، وبروتوكول النحو المبين هو مناسبة لأولئك الذين يبحثون لكسب مزيدا من الإيضاحات عن دور و / أو التعبير عن جينات مرتبطة الثانوية ينبع باستخدام منخفضة التكلفة، وسهلة من الناحية الفنية، والمتوسطة إلى طريقة إنتاجية عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول ISSA هي طريقة بسيطة وفعالة نسبيا لخلق أنسجة الجذعية المعدلة وراثيا في أنواع الأشجار في غضون بضعة أشهر لتحليل الجينات والمروجين للاهتمام المشاركين في الخشب وتنبع تشكيل. القليل من الجهد، وراء حفظ النباتات على قيد الحياة، وذلك لزراعة الأنسجة الجذعية المعدلة ور…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
