Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendrieten van dopaminerge neuronen te ontvangen en over te brengen synaptische input, ondersteuning actiepotentiaal back-vermeerdering en neurotransmitter release. Inzicht in deze fundamentele functies zal licht werpen op de uitwisseling van informatie in deze neuronen. Dendritische patch-clamp opnamen bieden de mogelijkheid om de elektrische eigenschappen van dendrieten en de onderliggende voltage-gated ionkanalen direct te onderzoeken. Echter, deze fijne structuren zijn moeilijk toegankelijk voor patch pipetten vanwege hun kleine diameter. Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap procedure voor stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopaminerge neuronen in acute plakjes verzamelen. Elektrofysiologische metingen worden gecombineerd met post hoc herstel van de morfologie van de cel. Succesvolle experimenten afhankelijk betere voorbereiding van segmenten, oplossingen en pipetten, adequate aanpassing van de optica en stabiliteit van de pipet in contact met de structuur opgenomen. Standard beginselen van de somatic patch-clamp-opname worden toegepast op dendrieten, maar met een zachtere aanpak van de pipet. Deze veelzijdige technieken kunnen worden toegepast op verschillende vragen over de prikkelbaar eigenschappen van dendrieten aan te pakken.
Neuronen ontvangen synaptische informatie voornamelijk op hun dendrieten. Prikkelende en remmende synaptische signalen verspreiden van hun plaats van generatie op de integratie plaats waar actiepotentialen (AP) worden opgeroepen als het uitgangssignaal. Onderweg wordt synaptische potentialen zowel door de structuur van dendrieten en de interactie tussen passieve en actieve membraaneigenschappen. De combinatie van deze zeer variabele parameters verbreedt de rekenkracht van neuronen 1,2. De kleine diameter van dendrieten belemmert echter de studie van hun elektrische eigenschappen. De voortdurende ontwikkeling van de patch-clamp techniek 3, hebben de optiek 4 en verfijning van methoden voor slice voorbereiding 5 gedurende de laatste decennia opnames nodig van heel dun (0,7-3 um Ø) dendrieten 6,7. Deze methoden waren en zijn nog steeds voornamelijk gebruikt om de prikkelbaarheid van dendrieten onderzoeken verschillende of neuronen 8. Direct dendritische opnamen zijn essentieel voor de distributie 9-19 en verschillen in de functionele eigenschappen van 20-22 ionkanalen in neuronale afzonderlijke compartimenten bepalen. Deze gegevens zijn de noodzakelijke aanvulling van ionkanaal distributies gedetecteerd met immunohistochemie gecombineerd om licht en elektronenmicroscopie 23,24. Dual somatodendritisch opnamen zijn genomen om de verspreiding van actiepotentialen 9,13-15,21,22,25-27 en het verspreiden van synaptische potentials 13,16,18 langs de somatodendritische domein van neuronen te verkennen, het verkrijgen van gedetailleerde passieve kabel modellen 28- 30 en onderzoek naar de temporele resolutie van neuronale integratie 31.
De substantia nigra (SN) is een regio gelegen in het betrokken bij verschillende functies, zoals de controle van de beweging, de codering van beloning en gewone gedrag middenhersenen. De afname van dopamine als gevolg van de specifiekeverlies van dopaminerge (DA) neuronen in de SN is gekoppeld aan de motorische stoornissen waargenomen bij patiënten met de ziekte 32 van Parkinson. De nigrale circuit bestaat uit twee celtypes: dopaminerge en GABA-erge neuronen. Interessant is dat deze neuronen aantal specifieke kenmerken die hen onderscheiden van andere neuronen. Het axon van een groot deel van DA neuronen en sommige GABA neuronen afkomstig van een dendritische plaats aangeeft dat de dendritische as heterogeen (axon-dragende en axon ontbreekt dendrieten) 25,26,33. De morfologie van deze neuronen contrast dan de typische organisatie van neuronen waarbij de informatieoverdracht volgt de wet van dynamische polarisatie uitgezonden door Cajal: vanaf dendrieten, tot soma en uiteindelijk Axon 34. DA neuronen is ook bekend dat dopamine ontheffen van hun dendrieten 35, genereren barsten activiteit 36 en NMDA-receptor 37 plasticiteit. de dissectie van deze verschijnselen is ongrijpbaar zonder direct opnamen van de plaats waar ze worden geïnitieerd. Om inzicht te krijgen in de relatie tussen de precieze locatie en functionele eigenschappen van ionkanalen en hun rol in de dendritische prikkelbaarheid en informatie-overdracht in nigrale neuronen, directe dendritische opnames zijn de methode van keuze.
Dit rapport beschrijft een gedetailleerde procedure die kan worden gebruikt voor enkele en dubbele patch-clamp van dendrieten van nigrale neuronen en de overeenkomstige post hoc biocytine labeling verkrijgen. De uitgangspunten voor het patchen van de somatische en de dendritische membraan zijn zeer vergelijkbaar. Praktisch echter opnamen van dendritische plaatsen vereisen specifieke optimalisatie in relatie tot somatische opnamen. Succesvolle dendritische opnames afhankelijk van de kwaliteit van de plakjes, optimale instelling van de optica, zwakke benadering van de patch pipet en stabiliteit van de opnames.
Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap protocol dual somatodendritische whole-cell opnames en lokale dendritische opnamen voeren. Het is nuttig voor het bepalen van de invloed van ionkanalen (dwz I h) op het tijdsverloop van postsynaptische potentialen en in kaart brengen van de verdeling van het ionkanaal (Ih) langs de somatodendritische domein van nigrale DA neuronen, respectievelijk. Resulterende elektrofysiologische metingen worden gecombineerd om hoc histochemie plaatsen op celmorfologie herstellen. De procedure werd gebruikt om DA neuronen in de substantia nigra onderzoeken, maar kan worden gegeneraliseerd naburige nigrale GABA neuronen, ventrale tegmentale gebied DA neuronen en andere neuronen van de middenhersenen. Alle stappen kunnen ook worden gevolgd om andere ionkanalen, uitgedrukt in dendrieten van nigrale neuronen zonder belangrijke wijzigingen te onderzoeken. Bericht hoc visualisatie is met name relevant voor de neuronen met axon-dragendedendrieten, zoals nigrale neuronen 25,26, hippocampus Oriens-Alveus interneuronen 21 of een CA1 piramidale neuronen 67. Interessant, neuronen het delen van deze functie lijkt vaker voor dan algemeen wordt gedacht 67 te zijn. Morfologische analyse toont ook de precieze positie van de elektroden en axon. De detectie van de laatste kan worden geoptimaliseerd door de etikettering van eiwitten tot expressie gebracht in de axon eerste segment (spanningsafhankelijke Na + kanalen of Ankyrin G) met behulp van immunohistochemie 68,69.
De betrouwbaarheid van de gegevens verzameld met dendritische opnames en daaropvolgende neuronale labeling steeds afhankelijk van de kwaliteit segment. Maximale inspanningen moeten derhalve worden toegepast om de levensvatbaarheid van cellen in het weefsel te behouden. Dit wordt bereikt met zachte behandeling van gezonde dieren, kwalitatief hoogwaardige gereedschappen en reagentia, voldoende zuurstofvoorziening van het weefsel en ijskoude temperaturen gedurende de voorbereiding van de schijfjes. Stabiele opname-omstandigheden een beroep doen op de selectie van gezonde neuronen. In de hele-cel functie zou serieweerstand aanvankelijk zo laag mogelijk en constant gehouden gedurende het experiment. De stabiliteit van de opnames is verder afhankelijk van hoogwaardige manipulatoren verstoken van drift en trillingen. Deze verstoringen kunnen worden gereduceerd door het optimaliseren van de pipet stabiliteit: het controleren van de verbinding met pipet houder en headstage, beheersen die micromanipulator kabels slap vermijden plotselinge temperatuurschommelingen of podium beweging en controleren van het mechanisme van de manipulator. Voor dubbele opnamen is methylsulfaat 13,15,21 opgenomen in de intracellulaire oplossing, maar gluconaat 9,14,25 alternatief kan worden toegepast. Echter, de belangrijkste anion de membraanpotentiaal 70,71 en sommige spanningsafhankelijke stroom 72 te wijzigen. Intracellulaire oplossing kan worden aangevuld met ATP, GTP en fosfocreatine de physiolo behoudengische functies van neuronen. Bovendien, het toevoegen van een fluorescerende kleurstof in de pipetoplossing (bijvoorbeeld Alexa 594 of Sulforhodamine 101 41) aan de dendrieten visualiseren tijdens een somatische opname kan nuttig zijn om bijvoorbeeld een drukuitoefening plaatsen (figuur 7 in Ref. 41) of een elektrische stimulerende pipet. De pipet oplossing-cel aangesloten opnamen bevat een hoge concentratie K + en Na + geen grote Ih opnemen. Opmerkelijk de concentratieverhouding Na + / K + beïnvloedt de amplitude 10, de omkeringspotentiaal van de huidige 11 en de gating van I h 73. Als alternatief kan ik u ook worden opgenomen met behulp van buiten-outs 10. In deze opname configuratie zonder dat door de intracellulaire milieu in de nabijheid van de kanalen worden verstoord. Bijgevolg verschillen in voltage-afhankelijke activering van I <sub> h werden vergelijkbare stromen verkregen met cellen verbonden patches en buiten-outs 10. Zwelling van neuronen wordt soms aangetroffen in patch-clamp en ontstaat vaak door verschillende oorzaken, zoals de lage kwaliteit van het water, sterke onbalans in osmolariteit en pH tussen de intra- en extracellulaire oplossingen 39 of fouten in de samenstelling van oplossingen. De kwaliteit van elektrofysiologische opnames heeft een directe invloed op de kwaliteit van de morfologie van teruggewonnen neuronen. Hoge weerstand somatische pipetten worden gebruikt voor dubbele opnamen (6-10 MQ, zoals in referentie 6,11.) En één somatische opnamen na-cel verbonden opnamen op de verdunning van het intracellulaire milieu 14 minimaliseren. De hele cellen somatische opname na-cel aangesloten opname dus kort gehouden (<10 min). Outside-out patches van zowel de somatische en dendritische pipetten zijn essentieel voor een goede afsluiting van het cell membraan en de daaropvolgende herstel van de cel morfologie. Naast de structuur van de cel, kan de neurochemische inhoud worden bepaald voor de opgenomen neuronen 59,74. Zo kan het intracellulaire tyrosine hydroxylase worden immunolabeled voor eenduidige identificatie van DA neuronen 13.
DA neuronen worden voornamelijk in de SN pars compacta, met een veel lagere dichtheid in de SN pars reticulata, waar ze worden vermengd met een groter aantal GABA neuronen 75. Terwijl het cellichaam van DA neuronen vaak groter dan die van GABA neuronen, de visuele identificatie van deze cellen met IR-videomicroscopie onzeker en gedeeltelijk belemmerd door de dekking van de pars compacta. Om deze beperkingen te omzeilen, kan de voorselectie van DA neuronen worden vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die een fluorescente merker in een specifieke populatie van neuronen (TH 65 of DAT voor DA neuronen, GADvoor GABA neuronen) en epifluorescentie verlichting. Alternatief kan een fluorescerende kleurstof in de oplossing van de somatische elektrode worden opgenomen om de visualisatie van dendrieten vergemakkelijken. Hogere resolutie van de fluorescerende cel wordt aangeboden door Nipkow draaiende schijf confocale 14,22,30 of twee-foton microscopie 7 gecombineerd om IR-DGC 6. Verscheidene voordelen gerelateerd aan DGC vergeleken met DIC. Ten eerste, zoals DIC prisma's niet nodig zijn, imago van de IR-DGC kan worden bedekt met een afbeelding fluorescentie 49,52,53,76. Ten tweede kan DGC worden gecombineerd met fotostimulering en optogenetics 77.
Een nadeel van slice voorbereiding is het behoud van de integriteit van neuronen. DA neuronen breiden hun dendrieten in de drie ruimtelijke vlakken 78,79 en derhalve afknotting van de dendritische compartiment kan niet volledig worden vermeden in plakken 80. De keuze van de oriëntatie van plakjes (coronale, horizontaal of parasagittale) is een trade-off. De oorsprong van de innervatie en de proefopzet moet worden geacht om de juiste oriëntatie van de plakken te selecteren.
Direct dendritische patches is de techniek om de verdeling van functionele ionkanalen kaart in de verschillende compartimenten van cellen. Daarnaast biedt deze techniek de variabiliteit in functionele eigenschappen kanalen 20 bepalen. Als aanvulling van de locatie en de dichtheid van ionkanalen kan worden vastgesteld met behulp van immunohistochemie op het Licht en elektronen microscopie niveaus 17,23. Deze benadering biedt de mogelijkheid om het kanaal dichtheid in klein kaliber structuren die niet toegankelijk zijn patch pipetten bepalen. Maar deze kanalen kan in een afzonderlijke functionele toestand 24 of zelfs inactief ten opzichte van die zijn opgenomen met patch-clamp technieken. Beide technieken zijn daarom nodig om een compleet beeld van de locatie en de eigenschappen van het verkrijgen vanionenkanalen in een specifieke cellulaire gebied 17. Met de ontwikkeling van spanningsgevoelige kleurstoffen, is spanning beeldvorming gebruikt om de verspreiding van AP's en EPSPS in neuronen op meerdere locaties 81 onderzocht. Als alternatief voor dubbele patch-clamp Deze benadering kan ook worden toegepast voor dunne dendrieten die niet toegankelijk patch pipetten maar vereisen nauwkeurige kalibratie van de signaal en middeling.
Terwijl DA neuronen in de SN en ventrale tegmentale gebied op grote schaal onderzocht middels somatische opnamen in de fysiologische en pathofysiologische context, de functionele eigenschappen van de dendrieten nog zwaar in beide gevallen. Patchen van dendrieten is geïmplementeerd voor nigrale dopamine neuronen door verschillende groepen met succes 13,25,26 en blijft de methode bij uitstek om prikkelbaar eigenschappen van deze fijne subcellulaire structuren 8 ontleden. Dendritische opnames zorgen voor een verdere MOGELIJKHEDEschap om de efficiëntie en de plasticiteit van synaptische transmissie en de plasticiteit van dendritische prikkelbaarheid 82,83 onderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
Ik dank Dr Vincent Seutin voor zijn voortdurende steun, Christelle Gillissen en Laurent Massotte voor een uitstekende technische bijstand, Drs Jean Defourny en Sandra Ormenese voor adviezen met de confocale microscoop, Dr Jacques Destiné voor de gave van de tweede Axopatch 200B versterker, de GIGA-Imaging platform voor het delen van de confocale microscoop en Imaris software en Dr Stephen Freeman voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Belgische FRS – FNRS (U.N002.13 en T.N0015.13) en gepubliceerd met de steun van de Belgische Universitaire Stichting (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |