Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendritter av dopaminerge nevroner motta og formidle synaptic innspill, støtte aksjonspotensial back-forplantning og frigjøring av nevrotransmittere. Forstå disse grunnleggende funksjonene vil belyse informasjonsoverføring i disse nevronene. Dendrittiske patch-clamp opptak gi mulighet til direkte å undersøke de elektriske egenskapene til dendritter og underliggende spenningsstyrte ionekanaler. Men disse fine strukturer er ikke lett tilgjengelig for patch pipetter grunn av sin lille diameter. Denne rapporten beskriver en trinn-for-trinn prosedyre for å samle stabil og pålitelig opptak fra dendritter av dopaminerge nevroner i akutte skiver. Elektrofysiologiske målinger kombineres med post hoc utvinning av cellemorfologi. Vellykkede forsøk er avhengige av forbedret fremstilling av skiver, løsninger og pipetter, tilstrekkelig justering av optikk og stabiliteten av pipetten i kontakt med den registrerte strukturen. Standard prinsipper Somatic patch-clamp opptak brukes til dendritter, men med en mildere tilnærming av pipetten. Disse allsidige teknikker kan implementeres for å håndtere ulike spørsmål som gjelder de hissige egenskapene dendritter.
Nerveceller motta synaptiske informasjon hovedsakelig på sine dendritter. Eksitatoriske og hemmende synaptiske signaler spres fra deres side av generasjon til integrering nettsted hvor aksjonspotensialer (APS) er fremkalt som utgangssignalet. På sin vei, er synaptiske potensialer påvirket av både strukturen i dendritter og samspillet mellom passive og aktive membranegenskaper. Kombinasjonen av disse svært variable parametre utvider regnekraft av nerveceller 1,2. Imidlertid liten diameter av dendritter hindrer imidlertid studier av deres elektriske egenskaper. Den kontinuerlige utviklingen av patch-clamp teknikken 3, har optikk 4 og foredling av metoder for skive forberedelse 5 i løpet av de siste tiårene aktivert opptak fra svært tynn (0,7 til 3 mikrometer Ø) dendritter 6,7. Disse metodene var, og er, fortsatt i stor grad brukes til å undersøke excitability av dendritter i en rekke of nevroner 8. Direkte dendrittiske opptak er avgjørende for å bestemme fordelingen 9-19 og forskjeller i de funksjonelle egenskaper 20-22 av ionekanaler i forskjellige nevronale avdelinger. Disse dataene er nødvendig supplement av ionekanal distribusjoner oppdages med immunhistokjemi sammen til lys- og elektronmikroskopi 23,24. Dual somatodendritic innspillinger er iverksatt for å utforske utbredelsen av aksjonspotensialer 9,13-15,21,22,25-27 og spredning av synaptiske potensialer 13,16,18 langs somatodendritic domenet av nerveceller, få detaljerte passive kabel modeller 28- 30 og undersøke tidsoppløsningen av nevronale integrering 31.
Substantia nigra (SN) er en region som ligger i midthjernen er involvert i flere funksjoner, som for eksempel kontroll av bevegelse, koding av belønning og fast atferd. Reduksjonen av dopamin på grunn av den spesifikketap av dopaminergiske (DA) neuroner i SN er forbundet med de motoriske forstyrrelser som observeres hos pasienter som lider av Parkinsons sykdom 32. Den nigral krets er sammensatt av to hovedcelletyper: dopaminerge og GABAergiske nevroner. Interessant, disse nevronene har flere spesifikke funksjoner som skiller dem fra andre nerveceller. Axon av en stor andel av DA nevroner og noen GABA nevroner stammer fra en dendrittiske nettstedet indikerer at dendrittiske arbor er heterogen (axon bærende og axon-mangler dendritter) 25,26,33. Morfologien av disse nevronene i kontrast derfor med den typisk organisering av neuroner i hvilken informasjonsoverføring følger loven om dynamisk polarisasjon som utsendes av Cajal: fra dendritter, til soma og til slutt til axon 34. DA-nevroner er også kjent for å frigjøre dopamin fra sine dendritter 35, generere sprengning aktivitet 36 og NMDA-reseptor-plastisitet 37. den dissecsjon av disse fenomenene er unnvikende uten direkte opptak fra stedet der de er igangsatt. For å få innsikt i forholdet mellom den nøyaktige beliggenheten og funksjonelle egenskaper av ionekanaler og deres rolle i dendrittiske oppstemthet og informasjonsoverføring i nigral nevroner, direkte dendrittiske innspillinger er metoden for valg.
Denne rapporten beskriver en detaljert fremgangsmåte som kan anvendes for å oppnå enkle og doble patch-clamp opptak av dendritter av nigral nevroner og den tilsvarende post hoc biocytin merking. De grunnleggende prinsipper for patching den somatiske og dendrittiske membranen er svært like. Praktisk talt imidlertid opptak fra dendrittiske områder krever spesifikke optimalisering i forhold til somatiske opptak. Vellykket dendrittiske opptak stole på kvaliteten på skivene, optimal justering av optikken, skånsom tilnærming av oppdateringen pipette og stabilitet av opptakene.
Denne rapporten beskriver en steg-for-steg-protokollen for å gjennomføre to somatodendritic hel-celle opptak og lokale dendrittiske opptak. Det er nyttig for å bestemme innvirkningen av ionekanaler (dvs. I h) på tidsforløpet av postsynaptiske potensialer og kartlegge fordelingen av ionekanalen (I h) langs somatodendritic domenet av nigral DA-neuroner, respektivt. Dannede elektrofysiologiske målinger kombineres for å legge hoc histokjemi å gjenopprette celle morfologi. Fremgangsmåten ble anvendt for å undersøke DA-nevroner lokalisert i substantia nigra, men kan generaliseres for nabo nigral GABA neuroner, ventrale tegmentale område DA-nevroner eller andre midthjernen nerveceller. Alle trinnene kan også følges for å undersøke andre ionekanaler uttrykt i dendritter av nigral nevroner uten viktige modifikasjoner. Post hoc visualisering er spesielt relevant for nevroner med axon bærendedendritter, for eksempel nigral nevroner 25,26, hippocampus Oriens-alveus interneurons 21 eller noen CA1 pyramidale nevroner 67. Interessant, nevroner som deler denne funksjonen ser ut til å være mer vanlig enn generelt antatt 67. Morfologisk analyse avslører også den nøyaktige plasseringen av elektrodene og axon. Påvisningen av den sistnevnte kan optimaliseres ved merking av proteiner uttrykt i axon innledende segment (spenningsstyrte Na + kanaler eller Ankyrin G) ved hjelp av immunhistokjemi 68,69.
Påliteligheten av data innsamlet med dendrittiske opptak og påfølgende neuronal merking alltid avhenger av skive kvalitet. Maksimal innsats må derfor anvendes for å opprettholde levedyktigheten av celler i vevet. Dette oppnås med skånsom håndtering av friske dyr, høykvalitets verktøy og reagenser, tilstrekkelig oksygenering av vev og iskalde temperaturer gjennom utarbeidelse av skiver. Stabile opptaksforhold stole på valg av sunne nevroner. I det hel-celle-modus, bør seriemotstand i utgangspunktet være så lav som mulig og holdt konstant gjennom hele forsøket. Stabiliteten av opptakene er videre avhengig av høy kvalitet manipulatorer blottet for drift og vibrasjoner. Disse forstyrrelsene kan reduseres ved å optimalisere pipette stabilitet: kontrollerer forbindelsen til pipetten holderen og til heads, kontroll av at mikromanipulator kabler er slakk, unngå plutselige endringer i temperatur eller stadium bevegelse og kontroll av mekanismen av manipulatoren. For to innspillinger har methylsulfate 13,15,21 blitt inkludert i den intracellulære løsning, men gluconate 9,14,25 kan alternativt benyttes. Imidlertid kan hoved anion endre membranpotensialet 70,71 og noen spenningsavhengige strøm 72. Intracellulær løsning kan suppleres med ATP, GTP og fosfokreatin å bevare physiolobiologiske funksjoner av nerveceller. I tillegg, å tilsette et fluorescerende fargestoff i pipetten oppløsning (f.eks Alexa 594 eller sulforodamin 101 41) for å visualisere de dendritter i løpet av en somatisk opptak kan være nyttig for eksempel for å plassere en trykkpåvirkning (fig 7 i Ref. 41) eller en elektrisk stimulerende pipette. Pipetten løsningen for celle-festet opptakene inneholder en høy K + konsentrasjon og ingen Na + til å spille inn store jeg h. Verdt å merke seg den Na + / K + konsentrasjonsforholdet påvirker strømamplitude 10, reversering potensial på dagens 11 og portstyrings av I h 73. Alternativt kan jeg h også bli tatt opp med utenfor-outs 10. I dette opptaket konfigurasjon kan imidlertid den intracellulære miljøet i nærhet av kanalene bli forstyrret. Følgelig forskjeller i spenningsavhengige aktivering av I <sub> h observeres når en sammenligner strømninger innhentet ved hjelp av celle festet lapper og utenfor-outs 10. Hevelse av nerveceller er av og til oppstått i løpet av patch-clamp-opptak, og ofte oppstår fra forskjellige årsaker, for eksempel den lave kvalitet på vannet, sterk ubalanse i osmolaritet eller pH mellom intra- og ekstracellulære løsninger 39 eller feil i sammensetningen av løsninger. Kvaliteten på elektrofysiologiske opptak har en direkte virkning på kvaliteten av morfologien av gjenopprettede neuroner. Høy motstand somatiske pipetter brukes for dual opptak (6 – 10 Megohm, som i Refs 6,11.) Og for enkeltsomatiske opptak etter celle-festet opptak for å minimere utvanning av den intracellulære miljø 14. Hel-celle somatisk opptak følgende celle-tilknyttet opptaket er derfor holdes kort (<10 minutter). Utenfor-out patcher fra både somatiske og dendrittiske pipetter er avgjørende for riktig lukking av cell membran og etterfølgende utvinning av cellemorfologi. I tillegg til cellens struktur, kan nevrokjemiske innhold bestemmes for de registrerte nevroner 59,74. For eksempel kan den intracellulære protein tyrosin hydroksylase bli immunolabeled for entydig identifikasjon av DA nevroner 13.
DA-nevroner er hovedsakelig konsentrert i SN pars compacta, med en mye lavere tetthet som er tilstede i SN pars reticulata, hvor de blir blandet med et høyere antall GABA neuroner 75. Mens cellen kroppen av DA nevroner er ofte større enn for GABA nerveceller, er usikkert og delvis hindret av tettheten av Pars comp visuell identifisering av disse cellene med IR-videomicroscopy. For å omgå disse begrensningene, kan den forhåndsvalg av DA nevroner forenkles ved bruk av transgene mus som uttrykker en fluoriserende fargestoff i en bestemt populasjon av nerveceller (TH 65 eller DAT for DA nevroner, GADfor GABA nevroner) og epifluorescence belysning. Alternativt kan et fluoriserende fargestoff inngå i løsningen av somatiske elektroden for å lette visualiseringen av dendritter. Økt oppløsning av fluorescerende celle er brakt av Nipkow spinnende disk confocal 14,22,30 eller to-foton mikroskopi 7 kombineres til IR-DGC 6. Flere fordeler knytter seg til DGC i forhold til DIC. Først, som DIC prismer ikke er nødvendig, IR-DGC bilde kan overlappes med en fluorescens bilde 49,52,53,76. For det andre kan DGC kombineres med photostimulation og optogenetics 77.
En ulempe ved fremstillingen skive er bevaring av integriteten av nerveceller. DA nevroner utvide sine dendritter i de tre romlige plan 78,79 og derfor avkutting av dendrittiske rommet ikke kan unngås helt i skiver 80. Valget av orienteringen av skiver (koronale, horisontal eller parasagittal) er en avveining. Opprinnelsen til innervasjon og eksperimentell design må anses å velge riktig orientering av skiver.
Direkte dendrittiske patching er teknikken som brukes til å kartlegge fordelingen av funksjonelle ionekanaler i de forskjellige avdelinger av celler. I tillegg har denne teknikken gir for å bestemme variasjonen i funksjonelle egenskaper til kanalene 20. Som et supplement plassering og tetthet av ionekanaler kan fastslås ved hjelp av immunhistokjemi på lys og elektronisk mikros nivåer 17,23. Denne fremgangsmåten gir også mulighet for å bestemme den kanal tettheten i småkalibrede strukturer som er utilgjengelige for patch-pipetter. Men disse kanalene kan være i en tydelig funksjonell tilstand 24 eller inaktiv i forhold til de som er registrert med patch-clamp teknikker. Begge teknikkene er derfor nødvendig for å få et fullstendig bilde av plasseringen og egenskapene tilionekanaler i en bestemt cellulær region 17. Med utviklingen av spenningsfølsomme fargestoffer, har spenningen avbildning blitt brukt til å undersøke forplantning av APS og EPSP i nerveceller på flere steder 81. Som et alternativ til to patch-clamp-opptak, kan denne fremgangsmåten også bli implementert for tynne dendritter som ikke er tilgjengelige for patch-pipetter, men nødvendiggjør nøyaktig kalibrering av signalet og i snitt.
Mens DA nevroner i SN og ventral tegmentale området er mye undersøkt via somatiske opptak i den fysiologiske og patofysiologiske sammenheng, funksjonelle egenskaper sine dendritter fortsatt i stor grad ukjent i begge forhold. Patching fra dendritter har blitt implementert for nigral dopamin nevroner av flere grupper med suksess 13,25,26 og er fortsatt den metoden for valg for å dissekere hissige egenskapene til disse fine subcellulære strukturer 8. Dendrittiske innspillinger gi en ytterligere opportuning til å granske effektivitet og plastisitet av synaptisk transmisjon og plastisitet av dendrittiske oppstemthet 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr Vincent Seutin for hans konstant støtte, Chrisgillissen og Laurent Massotte for utmerket teknisk assistanse, Drs Jean Defourny og Sandra Ormenese for råd med konfokal mikroskop, Dr Jacques DESTINE for gaven av andre Axopatch 200B forsterker, GIGA-Imaging plattform for deling av konfokal mikroskop og Imaris programvare og Dr Stephen Freeman for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra de belgiske FRS – FNRS (U.N002.13 og T.N0015.13) og publisert med støtte fra den belgiske Universitetet Foundation (publie avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |